基于理性设计的葡萄糖氧化酶性质改良
| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一部分 前言 | 第12-22页 |
| 1.1 酶分子改造技术 | 第12-15页 |
| 1.1.1 化学修饰法 | 第12-13页 |
| 1.1.2 生物酶工程法 | 第13-15页 |
| 1.2 酶分子改造的策略 | 第15-17页 |
| 1.2.1 非理性设计策略 | 第15-16页 |
| 1.2.2 理性设计策略 | 第16-17页 |
| 1.3 国内外研究现状及进展 | 第17-18页 |
| 1.4 葡萄糖氧化酶概述 | 第18-20页 |
| 1.5 蛋白质中甲硫氨酸被氧化的影响 | 第20-21页 |
| 1.6 本研究的目的和意义 | 第21-22页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第22-34页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-25页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第22页 |
| 2.1.2 培养基 | 第22-23页 |
| 2.1.3 主要试剂和酶 | 第23页 |
| 2.1.4 溶液及缓冲液 | 第23-24页 |
| 2.1.5 仪器及设备 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-34页 |
| 2.2.1 引物设计与目的基因的定点突变 | 第25-26页 |
| 2.2.2 凝胶回收目的DNA片段 | 第26页 |
| 2.2.3 载体与片段的连接 | 第26-27页 |
| 2.2.4 大肠杆菌的转化 | 第27-28页 |
| 2.2.5 质粒DNA的提取 | 第28-29页 |
| 2.2.6 毕赤酵母感受态的制备 | 第29页 |
| 2.2.7 线性化重组表达载体 | 第29页 |
| 2.2.8 纯化线性化DNA | 第29-30页 |
| 2.2.9 毕赤酵母的电击转化 | 第30页 |
| 2.2.10 毕赤酵母重组菌株的平板筛选 | 第30页 |
| 2.2.11 毕赤酵母重组菌株的摇瓶表达 | 第30-31页 |
| 2.2.12 SDS-PAGE检测目的蛋白 | 第31页 |
| 2.2.13 表达产物的分离纯化 | 第31页 |
| 2.2.14 酶活的测定 | 第31-33页 |
| 2.2.15 可溶蛋白的测定 | 第33页 |
| 2.2.16 抗氧化性的测定 | 第33-34页 |
| 第三部分 实验结果 | 第34-59页 |
| 3.1 计算机辅助分析GOD序列 | 第34-44页 |
| 3.1.1 GOD的同源比对及结合位点的推断 | 第34-35页 |
| 3.1.2 GOD突变体的同源建模 | 第35-41页 |
| 3.1.3 GOD及突变体和底物的分子对接 | 第41-44页 |
| 3.2 葡萄糖氧化酶及突变体表达载体的构建 | 第44-51页 |
| 3.2.1 葡萄糖氧化酶基因的获得 | 第44-46页 |
| 3.2.2 定点突变获得葡萄糖氧化酶突变基因 | 第46-48页 |
| 3.2.3 毕赤酵母表达载体的构建 | 第48-49页 |
| 3.2.4 重组载体的酶切验证 | 第49-51页 |
| 3.3 毕赤酵母的转化及重组菌株的平板筛选 | 第51-53页 |
| 3.4 发酵上清液SDS-PAGE检测 | 第53-54页 |
| 3.5 酶的分离纯化结果 | 第54页 |
| 3.6 GOD酶学性质研究 | 第54-59页 |
| 3.6.1 可溶蛋白及酶活测定 | 第54-56页 |
| 3.6.2 抗氧化性测定 | 第56-59页 |
| 第四部分 结论及讨论 | 第59-62页 |
| 4.1 结论 | 第59-60页 |
| 4.1.1 葡萄糖氧化酶突变菌株的酶活分析 | 第59-60页 |
| 4.1.2 葡萄糖氧化酶突变菌株抗氧化性分析 | 第60页 |
| 4.2 讨论 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
