| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 缩略词表 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-22页 |
| 1 前言 | 第13页 |
| 2 骨骼肌卫星细胞 | 第13-15页 |
| 2.1 骨骼肌卫星细胞的体外分离培养 | 第13-14页 |
| 2.2 骨骼肌卫星细胞的成肌过程 | 第14-15页 |
| 3 非编码RNA | 第15-20页 |
| 3.1 MicroRNA | 第15-16页 |
| 3.1.1 MicroRNA概述 | 第15-16页 |
| 3.1.2 MicroRNA在肌肉发育过程中的作用 | 第16页 |
| 3.2 LncRNA | 第16-20页 |
| 3.2.1 LncRNA的基本概述 | 第16-17页 |
| 3.2.2 LncRNA在骨骼肌生长发育过程中的作用 | 第17-19页 |
| 3.2.3 LncRNA在猪骨骼肌中的研究进展 | 第19-20页 |
| 4 本研究的目的和意义 | 第20-22页 |
| 第二章 材料与方法 | 第22-47页 |
| 1 实验材料 | 第22-26页 |
| 1.1 细胞与动物 | 第22页 |
| 1.2 菌株和载体 | 第22-23页 |
| 1.3 主要试剂和试剂盒 | 第23-24页 |
| 1.4 主要仪器和设备 | 第24-25页 |
| 1.5 应用的分析软件和生物信息学网站 | 第25-26页 |
| 2 实验方法 | 第26-47页 |
| 2.1 RACE扩增及序列检测 | 第26-30页 |
| 2.1.1 制备5’/3’RACE第一链 | 第26页 |
| 2.1.2 设计PCR扩增引物 | 第26-27页 |
| 2.1.3 快速扩增cDNAEnds | 第27-28页 |
| 2.1.4 琼脂糖凝胶电泳和成像 | 第28页 |
| 2.1.5 PCR产物的胶回收和克隆测序 | 第28-30页 |
| 2.2 RNA提取和cDNA制备 | 第30-33页 |
| 2.2.1 细胞RNA提取 | 第30-31页 |
| 2.2.2 组织RNA提取 | 第31页 |
| 2.2.3 cDNA反转录 | 第31-32页 |
| 2.2.4 miRNA茎环DNA逆转录 | 第32-33页 |
| 2.3 荧光定量PCR分析 | 第33-35页 |
| 2.3.1 PCR的引物设计 | 第33-34页 |
| 2.3.2 荧光定量PCR | 第34-35页 |
| 2.3.3 定量数据分析 | 第35页 |
| 2.4 原代骨骼肌卫星细胞的分离与纯化 | 第35-36页 |
| 2.4.1 骨骼肌卫星细胞的分离 | 第35-36页 |
| 2.4.2 差速贴壁法纯化猪骨骼肌卫星细胞 | 第36页 |
| 2.4.3 培养基的配置 | 第36页 |
| 2.4.4 骨骼肌细胞的鉴定 | 第36页 |
| 2.5 细胞培养 | 第36-37页 |
| 2.5.1 增殖培养 | 第36-37页 |
| 2.5.2 分化培养 | 第37页 |
| 2.5.3 细胞冻存 | 第37页 |
| 2.5.4 细胞复苏 | 第37页 |
| 2.6 AK394747基因干扰片段设计 | 第37-38页 |
| 2.7 AK394747超表达载体的构建 | 第38-40页 |
| 2.7.1 AK394747目的片段合成 | 第38页 |
| 2.7.2 载体连接和转化 | 第38页 |
| 2.7.3 单克隆培养鉴定 | 第38页 |
| 2.7.4 质粒小量提取 | 第38-39页 |
| 2.7.5 pcDNA3.1载体连接转化 | 第39页 |
| 2.7.6 质粒无内毒素提取 | 第39-40页 |
| 2.8 细胞转染 | 第40-41页 |
| 2.9 EdU染色 | 第41-43页 |
| 2.9.1 EdU标记 | 第41页 |
| 2.9.2 细胞固定化 | 第41页 |
| 2.9.3 Apollo染色 | 第41-42页 |
| 2.9.4 DNA染色 | 第42页 |
| 2.9.5 DAPI染色 | 第42页 |
| 2.9.6 图片获取及分析 | 第42-43页 |
| 2.10 RTCA xCELLigence细胞增殖检测 | 第43-44页 |
| 2.10.1 细胞悬液准备 | 第43页 |
| 2.10.2 E-Plate16准备 | 第43页 |
| 2.10.3 RTCA程序设置 | 第43页 |
| 2.10.4 结果分析 | 第43-44页 |
| 2.11 细胞蛋白提取 | 第44页 |
| 2.12 蛋白浓度的测定 | 第44页 |
| 2.13 Western blotting分析 | 第44-46页 |
| 2.14 免疫荧光分析 | 第46-47页 |
| 第三章 结果和分析 | 第47-65页 |
| 1 猪骨骼肌细胞的分离与鉴定 | 第47-50页 |
| 1.1 骨骼肌细胞的纯化与培养 | 第47页 |
| 1.2 骨骼肌细胞的纯度检测 | 第47-48页 |
| 1.3 猪骨骼肌卫星细胞成肌分化标志基因表达检测 | 第48-50页 |
| 1.3.1 在mRNA水平检测骨骼肌细胞的分化标志基因表达 | 第48-49页 |
| 1.3.2 在蛋白水平上检测骨骼肌细胞分化标志基因表达 | 第49页 |
| 1.3.3 原位水平检测骨骼肌细胞的分化标志基因表达 | 第49-50页 |
| 2 LncRNA-AK394747的基本特征分析 | 第50-54页 |
| 2.1 AK394747全长序列与分析 | 第50-53页 |
| 2.1.1 细胞总RNA的完整性和纯度检测 | 第50-51页 |
| 2.1.2 AK394747的5’RACE和3’RACE结果 | 第51-52页 |
| 2.1.3 AK394747编码能力预测 | 第52页 |
| 2.1.4 AK394747位置预测 | 第52-53页 |
| 2.2 AK394747组织表达谱分析 | 第53页 |
| 2.3 AK394747在猪骨骼肌细胞分化过程中的表达情况 | 第53-54页 |
| 3 AK394747的功能研究 | 第54-62页 |
| 3.1 干扰AK394747对骨骼肌细胞增殖的影响 | 第54-57页 |
| 3.1.1 AK394747干扰片段的筛选及转染效率的检测 | 第54-55页 |
| 3.1.2 干扰AK394747对骨骼肌细胞增殖及其相关基因的影响 | 第55-57页 |
| 3.2 干扰AK394747对骨骼肌细胞分化的影响 | 第57-60页 |
| 3.3 AK394747超表达载体的构建 | 第60-62页 |
| 3.3.1 超表达载体的构建及效率检测 | 第60-61页 |
| 3.3.2 超表达AK394747对骨骼肌细胞增殖的影响 | 第61-62页 |
| 4 AK394747的作用机制初步研究 | 第62-65页 |
| 4.1 AK394747可能结合miRNA的筛选 | 第62-63页 |
| 4.2 AK394747对miR-32的作用 | 第63页 |
| 4.3 AK394747与Notch通路的相互作用 | 第63-65页 |
| 第四章 讨论 | 第65-69页 |
| 1 骨骼肌卫星细胞的体外培养 | 第65-67页 |
| 1.1 骨骼肌卫星细胞的分离方法 | 第65页 |
| 1.2 骨骼肌卫星细胞的纯化 | 第65-66页 |
| 1.3 骨骼肌卫星细胞的培养和鉴定 | 第66-67页 |
| 2 AK394747基因的功能分析 | 第67页 |
| 3 AK394747基因作用机制的分析 | 第67-69页 |
| 第五章 小结 | 第69-70页 |
| 1 本研究主要结论 | 第69页 |
| 2 本研究的创新点 | 第69页 |
| 3 下一步计划 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
