| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略词表(Abbreviation) | 第10-12页 |
| 1.文献综述 | 第12-25页 |
| 1.1 六型分泌系统概述 | 第12-17页 |
| 1.1.1 六型分泌系统简介 | 第12-13页 |
| 1.1.2 六型分泌系统的结构与组装 | 第13-14页 |
| 1.1.3 六型分泌系统的效应因子 | 第14-17页 |
| 1.2 hcp基因研究进展 | 第17-20页 |
| 1.2.1 hcp的基因功能及研究进展 | 第17-19页 |
| 1.2.2 Hcp蛋白结构研究进展 | 第19-20页 |
| 1.3 病原菌分泌系统和宿主炎性小体相互作用的研究进展 | 第20-23页 |
| 1.3.1 天然免疫 | 第20-21页 |
| 1.3.2 炎性小体及其在疾病中的作用 | 第21-22页 |
| 1.3.3 炎性小体的结构、激活和调控机制 | 第22页 |
| 1.3.4 致病菌的分泌系统 | 第22-23页 |
| 1.4 致病性大肠杆菌中T6SS研究进展 | 第23-25页 |
| 2.研究目的与意义 | 第25-26页 |
| 3.材料与方法 | 第26-40页 |
| 3.1 实验材料 | 第26-30页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第26-27页 |
| 3.1.2 细胞及实验动物 | 第27页 |
| 3.1.3 工具酶及主要试剂、试剂盒及仪器 | 第27-28页 |
| 3.1.4 实验所用手术器械 | 第28页 |
| 3.1.5 培养基及抗生素的配制 | 第28-29页 |
| 3.1.6 主要缓冲液与相关溶液及其配制 | 第29页 |
| 3.1.6.1 琼脂糖凝胶电泳缓冲液及其配制 | 第29页 |
| 3.1.6.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液及试剂 | 第29页 |
| 3.1.6.3 其它缓冲液的制备 | 第29页 |
| 3.1.7 引物 | 第29-30页 |
| 3.2 实验方法 | 第30-40页 |
| 3.2.1 猪源肠外致病性大肠杆菌的培养及基因组的提取 | 第30页 |
| 3.2.2 真核表达质粒的构建 | 第30-32页 |
| 3.2.3 细胞的培养 | 第32-33页 |
| 3.2.3.1 RAW264.7细胞的培养 | 第32页 |
| 3.2.3.2 HEK-293T细胞的培养 | 第32-33页 |
| 3.2.4 细胞感染实验 | 第33页 |
| 3.2.5 小鼠感染试验 | 第33页 |
| 3.2.6 酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第33页 |
| 3.2.7 TCA-丙酮沉淀法浓缩细胞分泌蛋白 | 第33-34页 |
| 3.2.8 乳酸脱氢酶LDH细胞毒性检测 | 第34页 |
| 3.2.9 细胞的转染 | 第34-36页 |
| 3.2.9.1 去内毒素质粒大提 | 第34-35页 |
| 3.2.9.2 质粒的转染 | 第35-36页 |
| 3.2.10 WesternBlotting | 第36页 |
| 3.2.11 细菌RNA的提取及浓度的测定 | 第36-37页 |
| 3.2.12 cDNA模板制备 | 第37-38页 |
| 3.2.12.1 gDNA去除 | 第37页 |
| 3.2.12.2 逆转录cDNA | 第37-38页 |
| 3.2.13 SYBRGreen法荧光定量PCR | 第38页 |
| 3.2.14 转录组测序及数据的分析 | 第38-39页 |
| 3.2.15 使用生物学软件 | 第39页 |
| 3.2.16 统计学分析 | 第39-40页 |
| 4.结果与分析 | 第40-49页 |
| 4.1 PCN033感染后RAW264.7的转录组测序分析 | 第40-43页 |
| 4.1.1 RNA样品质量检测 | 第40页 |
| 4.1.2 差异基因统计及富集分析 | 第40-41页 |
| 4.1.3 差异基因的GO功能分类 | 第41-42页 |
| 4.1.4 差异基因的KEGG代谢通路分析 | 第42-43页 |
| 4.2 qRT-PCR验证RNA-seq结果 | 第43页 |
| 4.3 PCN033感染激活NF-κB信号通路和NLRP3、NLRC4炎性小体 | 第43-44页 |
| 4.4 乳酸脱氢酶LDH细胞毒性检测 | 第44页 |
| 4.5 小鼠体内炎性因子IL-1β的变化 | 第44-45页 |
| 4.6 T6SS参与PCN033感染激活宿主细胞RAW264.7的NF-κB信号通路和NLRP3、NLRC4炎性小体 | 第45页 |
| 4.7 感染后RAW264.7炎性因子的转录 | 第45-46页 |
| 4.8 T6SS参与PCN033对caspase1活化和pro-IL-1β加工的影响 | 第46-47页 |
| 4.9 猪源肠外致病性大肠杆菌hcp1、hcp2、hcp3的真核表达 | 第47-49页 |
| 4.9.1 P3×FLAG-CMV14-hcp1/hcp2/hcp3真核表达质粒的构建 | 第47-48页 |
| 4.9.2 Hcp1、Hcp2、Hcp3蛋白的真核表达 | 第48-49页 |
| 5.讨论 | 第49-52页 |
| 5.1 PCN033感染对RAW264.7转录组的影响 | 第49页 |
| 5.2 缺失株Δhcp1Δhcp2Δhcp3的选定 | 第49-50页 |
| 5.3 T6SS在PCN033与宿主互作过程中的作用 | 第50-51页 |
| 5.4 真核表达质粒构建 | 第51页 |
| 5.5 后续工作展望 | 第51-52页 |
| 6.结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
