| 摘要 | 第7-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩略语表 | 第13-14页 |
| 1 前言 | 第14-44页 |
| 1.1 古菌 | 第14-16页 |
| 1.1.1 古菌概述 | 第14-15页 |
| 1.1.2 硫化叶菌 | 第15-16页 |
| 1.2 CRISPR-Cas系统 | 第16-21页 |
| 1.2.1 CRISPR-Cas系统的发现 | 第17页 |
| 1.2.2 CRISPR-Cas系统的结构和功能 | 第17-19页 |
| 1.2.3 CRISPR-Cas系统的分类和进化 | 第19-21页 |
| 1.3 CRISPR-Cas系统的机制研究 | 第21-28页 |
| 1.3.1 新间隔序列的获取 | 第22-24页 |
| 1.3.2 crRNA的加工 | 第24-26页 |
| 1.3.3 核酸的干涉 | 第26-28页 |
| 1.4 Ⅲ型CRISPR-Cas系统的干涉机制 | 第28-36页 |
| 1.4.1 复合体的组装 | 第29-31页 |
| 1.4.2 自我识别机制 | 第31-32页 |
| 1.4.3 核酸干涉机制 | 第32-36页 |
| 1.5 S.islandicusREY15A的CRISPR-Cas系统 | 第36-39页 |
| 1.6 CRISPR-Cas系统的应用 | 第39-42页 |
| 1.7 本研究的目的和意义 | 第42-44页 |
| 2 材料与方法 | 第44-63页 |
| 2.1 菌株和质粒 | 第47-51页 |
| 2.2 培养基配方及培养条件 | 第51-53页 |
| 2.2.1 大肠杆菌的培养基及培养条件 | 第51-52页 |
| 2.2.2 硫化叶菌的培养基及培养条件 | 第52-53页 |
| 2.3 主要分子生物学试剂 | 第53-54页 |
| 2.4 主要实验仪器 | 第54页 |
| 2.5 实验方法 | 第54-63页 |
| 2.5.1 大肠杆菌JM109的感受态制备和转化 | 第54-55页 |
| 2.5.2 硫化叶菌感受态的制备和电击转化法 | 第55-57页 |
| 2.5.3 含人工mini-CRISPR的干涉质粒和互补质粒的构建 | 第57页 |
| 2.5.4 基因编辑质粒的构建 | 第57-58页 |
| 2.5.5 提取硫化叶菌总DNA | 第58页 |
| 2.5.6 提取硫化叶菌总RNA | 第58页 |
| 2.5.7 实时荧光定量PCR分析 | 第58-59页 |
| 2.5.8 β-半乳糖苷酶酶活分析 | 第59-60页 |
| 2.5.9 天然Cmr-α复合物的纯化 | 第60页 |
| 2.5.10 SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳 | 第60页 |
| 2.5.11 crRNA的提取和标记 | 第60-61页 |
| 2.5.12 Cmr-α复合物的ssRNA切割活性分析 | 第61页 |
| 2.5.13 Cmr-α复合物的ssDNA切割活性分析 | 第61页 |
| 2.5.14 Cmr-α复合物的ssRNA结合活性分析 | 第61-62页 |
| 2.5.15 Cmr-α复合物的环腺苷酸合成活性分析 | 第62-63页 |
| 3 结果与分析 | 第63-97页 |
| 3.1 Cmr1α能够有效增强Cmr-α复合物的入侵质粒沉默活性 | 第63-78页 |
| 3.1.1 缺失Cmr1α能够差异影响SisCmr-α复合物的核酸干涉活性 | 第63-65页 |
| 3.1.2 Cmr2α-6α形成的核心核蛋白复合物展现较低核酸切割活性 | 第65-68页 |
| 3.1.3 Cmr1α的不同保守位点对Cmr-α复合体的核酸干涉影响不同 | 第68-73页 |
| 3.1.4 Cmr1α突变的Cmr-α复合体展现独特的核酸切割活性 | 第73-78页 |
| 3.2 Cmr4α在Cmr-α复合体变构激活调控过程中的重要功能 | 第78-97页 |
| 3.2.1 Cmr4α的保守位点对Cmr-α复合体干涉活性的差异影响 | 第79-82页 |
| 3.2.2 Cmr4α突变的Cmr-α复合体展现独特的核酸切割活性 | 第82-85页 |
| 3.2.3 Cmr4α-D27A突变亚基只有在形成三元复合物时才会致死细胞 | 第85-87页 |
| 3.2.4 Cmr4α_D27A突变能够加剧Cmr-α复合体的不稳定性 | 第87-88页 |
| 3.2.5 Cmr4α-D27A突变能够增强Cmr2αHD结构域的致死活性 | 第88-92页 |
| 3.2.6 Cmr-α系统存在干涉RNA的潜在活性位点 | 第92-94页 |
| 3.2.7 Cmr4α_D27A突变复合体与靶标RNA呈现独特的结合模式 | 第94-97页 |
| 4 讨论与展望 | 第97-105页 |
| 4.1 Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统的进化适应性 | 第97-99页 |
| 4.2 冰岛硫化叶菌Ⅲ-B型Cmr-α系统的干涉机制 | 第99-102页 |
| 4.3 Ⅲ型CRISPR-Cas系统激活调控机制的生物学意义 | 第102-105页 |
| 参考文献 | 第105-118页 |
| 附录 | 第118-129页 |
| 附录A.本研究所用引物 | 第118-125页 |
| 附录B.本研究所用核酸底物 | 第125-126页 |
| 附录C.RNA干涉质粒构建方法及RNA干涉检测原理 | 第126-127页 |
| 附录D.干涉质粒转化效率法检测入侵质粒沉默活性的原理 | 第127-128页 |
| 附录E.荧光定量PCR引物Q_(tar)和Q_(ref)的扩增效率 | 第128-129页 |
| 博士期间成果 | 第129-130页 |
| 致谢 | 第130-131页 |
