| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 主要缩写说明 | 第10-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-31页 |
| 1 副猪嗜血杆菌概述 | 第17-18页 |
| 2 副猪嗜血杆菌致病机制 | 第18-20页 |
| 2.1 副猪嗜血杆菌中IgA蛋白酶的活性 | 第18页 |
| 2.2 副猪嗜血杆菌逃避宿主肺部的先天免疫反应 | 第18-19页 |
| 2.3 H.parasuis抵抗补体依赖性血清杀菌活性 | 第19-20页 |
| 2.4 副猪嗜血杆菌黏附和入侵宿主细胞 | 第20页 |
| 3 副猪嗜血杆菌毒力因子研究进展 | 第20-25页 |
| 3.1 外膜蛋白P2 | 第22-23页 |
| 3.2 脂寡糖(LOS)的甲硫氨酰转移酶 | 第23-24页 |
| 3.3 GalU和GalE | 第24页 |
| 3.4 CDTs | 第24-25页 |
| 4 双组份调控系统概述 | 第25-26页 |
| 5 ArcA研究进展 | 第26-29页 |
| 5.1 大肠杆菌ArcA的研究 | 第27页 |
| 5.2 伤寒沙门氏菌ArcA研究 | 第27-28页 |
| 5.3 胸膜肺炎放线杆菌ArcA的研究 | 第28页 |
| 5.4 流感嗜血杆菌杆菌ArcA的研究 | 第28-29页 |
| 研究目的及意义 | 第29-30页 |
| 技术路线 | 第30-31页 |
| 第二章 副猪嗜血杆菌⊿arcA缺失株的构建 | 第31-49页 |
| 1 引言 | 第31页 |
| 2 材料 | 第31-34页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第31-32页 |
| 2.2 主要药品及试剂 | 第32-33页 |
| 2.3 主要培养基和试剂 | 第33页 |
| 2.4 主要仪器 | 第33页 |
| 2.5 引物 | 第33-34页 |
| 3 实验方法 | 第34-39页 |
| 3.1 副猪嗜血杆菌复壮与基因组的提取 | 第34页 |
| 3.2 arcA基因的克隆 | 第34-35页 |
| 3.3 原核表达载体构建 | 第35页 |
| 3.4 重组蛋白的初步表达鉴定 | 第35-36页 |
| 3.5 重组蛋白表达诱导时间的优化 | 第36页 |
| 3.6 重组蛋白表达IPTG浓度的优化 | 第36页 |
| 3.7 重组蛋白表达诱导温度的优化 | 第36页 |
| 3.8 重组蛋白的大量诱导表达 | 第36页 |
| 3.9 重组蛋白的纯化 | 第36页 |
| 3.10 多克隆抗体的制备及效价测定 | 第36-37页 |
| 3.11 arcA基因上臂+Kan基因+下臂片段的克隆、融合 | 第37-38页 |
| 3.12 构建重组自杀性质粒pAD | 第38页 |
| 3.13 自然转化方法构建arcA基因缺失株 | 第38页 |
| 3.14 互补质粒pCA的构建 | 第38页 |
| 3.15 互补菌株C-△arcA的构建 | 第38-39页 |
| 4 结果 | 第39-47页 |
| 4.1 arcA基因的PCR扩增、克隆及测序 | 第39-40页 |
| 4.2 原核表达载体构建结果 | 第40-41页 |
| 4.3 重组蛋白的初步表达鉴定 | 第41-42页 |
| 4.4 诱导时间优化 | 第42页 |
| 4.5 IPTG诱导浓度优化 | 第42-43页 |
| 4.6 诱导温度优化 | 第43页 |
| 4.7 ArcA重组蛋白的纯化 | 第43-44页 |
| 4.8 多克隆抗体血清的效价 | 第44页 |
| 4.9 arcA基因上臂、Kan基因和下臂片段的克隆与融合 | 第44-45页 |
| 4.10 构建重组自杀性质粒pAD | 第45-46页 |
| 4.11 自然转化方法构建arcA基因缺失株 | 第46页 |
| 4.12 互补菌株pCA的构建 | 第46页 |
| 4.13 互补菌株C-△arcA的构建 | 第46-47页 |
| 5 分析讨论 | 第47-48页 |
| 6 小结 | 第48-49页 |
| 第三章 副猪嗜血杆菌EP3株AarcA缺失株的生物学特性的研究 | 第49-57页 |
| 1 引言 | 第49页 |
| 2 材料 | 第49-50页 |
| 2.1 菌株 | 第49页 |
| 2.2 主要药品及试剂 | 第49页 |
| 2.3 主要培养基和试剂 | 第49-50页 |
| 2.4 主要仪器 | 第50页 |
| 2.5 实验动物 | 第50页 |
| 3 实验方法 | 第50-52页 |
| 3.1 副猪嗜血杆菌复壮 | 第50-51页 |
| 3.2 生长曲线的初步测定 | 第51页 |
| 3.3 自凝集实验 | 第51页 |
| 3.4 生物膜形成实验 | 第51页 |
| 3.5 血清敏感性实验 | 第51页 |
| 3.6 动物毒力实验 | 第51-52页 |
| 4 实验结果 | 第52-55页 |
| 4.1 生长曲线的初步测定 | 第52页 |
| 4.2 自凝集实验 | 第52-53页 |
| 4.3 血清敏感性实验 | 第53-54页 |
| 4.4 生物膜形成实验 | 第54-55页 |
| 4.5 动物毒力实验 | 第55页 |
| 5 讨论 | 第55-56页 |
| 6 小结 | 第56-57页 |
| 第四章 亲本株EP3和AarcA缺失株的比较转录组学研究 | 第57-71页 |
| 1 引言 | 第57页 |
| 2 材料 | 第57-58页 |
| 2.1 菌株 | 第57页 |
| 2.2 主要仪器 | 第57-58页 |
| 2.3 主要试剂 | 第58页 |
| 3 实验方法 | 第58-61页 |
| 3.1 副猪嗜血杆菌培养与菌体收集 | 第58页 |
| 3.2 提取细菌总RNA | 第58-59页 |
| 3.3 CDNA的合成 | 第59页 |
| 3.4 RNA-seq实验 | 第59页 |
| 3.5 荧光定量PCR | 第59-61页 |
| 4 实验结果 | 第61-68页 |
| 4.1 总RNA抽提后检测结果 | 第61-62页 |
| 4.2 筛选差异基因的结果 | 第62-65页 |
| 4.3 野毒株EP3与缺失株△ArcA差异基因的GO富集分析 | 第65-67页 |
| 4.4 野毒株EP3与缺失株△ArcA差异基因的KEGG富集分析 | 第67-68页 |
| 5 讨论 | 第68-70页 |
| 6 小结 | 第70-71页 |
| 第五章 亲本株EP3和△arcA缺失株的比较蛋白组学研究 | 第71-87页 |
| 1 引言 | 第71页 |
| 2 材料 | 第71-72页 |
| 2.1 菌株 | 第71页 |
| 2.2 主要仪器设备 | 第71-72页 |
| 3 实验方法 | 第72-77页 |
| 3.1 副猪嗜血杆菌的培养 | 第72页 |
| 3.2 蛋白质样品制备 | 第72-73页 |
| 3.3 蛋白定量 | 第73页 |
| 3.4 iTRAQ 实验 | 第73-75页 |
| 3.5 生物信息学分析 | 第75-76页 |
| 3.6 荧光定量PCR | 第76-77页 |
| 4 实验结果 | 第77-85页 |
| 4.1 Bradford法蛋白定量 | 第77-78页 |
| 4.2 筛选差异蛋白筛选的结果 | 第78-82页 |
| 4.3 野毒株EP3与缺失株△ArcA差异蛋白的GO富集性分析 | 第82-84页 |
| 4.4 野毒株EP3与缺失株△ArcA差异蛋白的KEGG富集分析 | 第84-85页 |
| 5 分析讨论 | 第85-86页 |
| 6 小结 | 第86-87页 |
| 全文结论 | 第87-88页 |
| 全文创新点 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-98页 |
| 致谢 | 第98-99页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第99-100页 |
| 附录 | 第100-102页 |
