| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 符号说明及缩写词 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-26页 |
| 1.1 小单孢菌及其遗传操作 | 第12-19页 |
| 1.1.1 小单孢菌概述 | 第12-14页 |
| 1.1.2 小单孢菌产生的生物活性物质 | 第14-15页 |
| 1.1.3 小单孢菌的遗传操作 | 第15-19页 |
| 1.1.3.1 小单孢菌的原生质体融合和原生质体转化 | 第16-17页 |
| 1.1.3.2 小单孢菌的噬菌体的转染 | 第17-18页 |
| 1.1.3.3 小单孢菌的电转化 | 第18页 |
| 1.1.3.4 小单孢菌的属间接合转移 | 第18-19页 |
| 1.2 安莎霉素类抗生素概述 | 第19-21页 |
| 1.2.1 安莎霉素类抗生素的分类及生理活性 | 第19-20页 |
| 1.2.2 安莎霉素类抗生素的生物合成 | 第20-21页 |
| 1.2.2.1 安莎霉素类抗生素的合成途径 | 第20页 |
| 1.2.2.2 安莎霉素类抗生素合成起始单元AHBA | 第20-21页 |
| 1.3 抗生素生物合成的途径特异性调控 | 第21-22页 |
| 1.4 本论文开展思路 | 第22-26页 |
| 第二章 小单孢菌遗传操作体系的建立及优化 | 第26-50页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-30页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第26-27页 |
| 2.1.2 培养基 | 第27-29页 |
| 2.1.3 试剂 | 第29-30页 |
| 2.1.3.1 常用试剂配制 | 第29页 |
| 2.1.3.2 试剂的选购 | 第29-30页 |
| 2.1.4 主要仪器设备和耗材 | 第30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-37页 |
| 2.2.1 A29常用抗生素敏感性测定 | 第30-31页 |
| 2.2.2 A29菌丝体的培养条件优化 | 第31页 |
| 2.2.3 A29菌丝体生长曲线的测定 | 第31-32页 |
| 2.2.4. A29菌丝体OD_(600)-cfu/ml曲线的测定 | 第32页 |
| 2.2.5 A29菌丝体电转化 | 第32-33页 |
| 2.2.5.1 A29电转感受态菌丝体的制备 | 第32-33页 |
| 2.2.5.2 A29菌丝体电转化 | 第33页 |
| 2.2.6 A29菌丝体接合转移体系的构建及优化 | 第33-37页 |
| 2.2.6.1 A29菌丝体接合转移 | 第33-35页 |
| 2.2.6.2 A29菌丝体不同生长状态下接合转移效率的测定 | 第35-36页 |
| 2.2.6.3 不同接合转移培养基条件下接合转移效率的测定 | 第36页 |
| 2.2.6.4 不同接合转移供受比条件下接合转移效率的测定 | 第36页 |
| 2.2.6.5 A29菌丝体不同大小的插入片段接合转移效率的测定 | 第36-37页 |
| 2.2.6.6 多株不同种类小单孢菌于优化条件下接合转移效率测定 | 第37页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第37-48页 |
| 2.3.1 A29对常用抗生素敏感性测定结果 | 第37-38页 |
| 2.3.2 A29菌丝体的最佳培养条件的确定 | 第38-40页 |
| 2.3.3 A29菌丝体生长曲线 | 第40-41页 |
| 2.3.4 A29菌丝体OD_(600)-cfu/ml(10~5)曲线 | 第41页 |
| 2.3.5 A29菌丝体电转化结果 | 第41-42页 |
| 2.3.6 大肠杆菌-小单孢菌属间接合转移体系的构建及优化结果 | 第42-48页 |
| 2.3.6.1 A29菌丝体接合转移效率的计算方法 | 第42-43页 |
| 2.3.6.2 A29菌丝体最佳生长状态的确定 | 第43-44页 |
| 2.3.6.3 最佳接合转移培养基的确定 | 第44-45页 |
| 2.3.6.4 最佳接合转移供受比的确定 | 第45-46页 |
| 2.3.6.5 不同大小的插入片段对A29菌丝体接合转移效率的影响 | 第46-47页 |
| 2.3.6.6 多株小单孢菌于优化条件下的接合转移效率 | 第47-48页 |
| 2.4 本章总结与展望 | 第48-50页 |
| 第三章 含AHBA合成基因的次级代谢途径激活 | 第50-81页 |
| 3.1 实验材料 | 第50-54页 |
| 3.1.1 菌株及质粒 | 第50-51页 |
| 3.1.2 培养基 | 第51页 |
| 3.1.3 试剂 | 第51-53页 |
| 3.1.3.1 常用溶液配制 | 第51-53页 |
| 3.1.3.2 常用试剂盒及其他生化试剂 | 第53页 |
| 3.1.4 主要仪器设备和耗材 | 第53-54页 |
| 3.2 实验方法 | 第54-66页 |
| 3.2.1 本章使用的引物信息 | 第54-57页 |
| 3.2.2 含AHBA合成基因簇克隆的fosmid文库筛选 | 第57-59页 |
| 3.2.3 xzqh12和A29目标基因簇中LuxR基因过表达重组质粒的构建 | 第59-60页 |
| 3.2.4 pSET152-rpoABC整合型重组质粒的构建 | 第60-61页 |
| 3.2.5 目标基因簇中相关基因片段敲除质粒的构建 | 第61-63页 |
| 3.2.6 大肠杆菌-链霉菌属间接合转移(孢子法) | 第63-64页 |
| 3.2.7 大肠杆菌-小单孢菌属间接合转移(菌丝体法) | 第64页 |
| 3.2.8 敲除株及过表达菌株的获得及验证 | 第64-65页 |
| 3.2.9 突变株及野生型菌株的发酵及HPLC检测 | 第65-66页 |
| 3.2.10 黑色素报告基因检测ermE~*p在A29中的启动强度 | 第66页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第66-78页 |
| 3.3.1 xzqh12或A29目标基因簇的获得及分析 | 第66-69页 |
| 3.3.2 xzqh12中含AHBA合成基因的次级代谢途径激活结果 | 第69-73页 |
| 3.3.2.1 xzqh12中含AHBA合成基因的次级代谢途径表达水平的检测 | 第69-71页 |
| 3.3.2.2 xzqh12中含AHBA合成基因的ansa类次级代谢途的激活 | 第71-73页 |
| 3.3.3 A29中含AHBA合成基因的PKS-NRPS杂合途径激活结果 | 第73-78页 |
| 3.3.3.1 A29中含AHBA合成基因NRPS-PKS杂合途径表达水平的检测 | 第74-76页 |
| 3.3.3.2 A29中含AHBA合成基因NRPS-PKS杂合途径的激活 | 第76-78页 |
| 3.4 本章总结与展望 | 第78-81页 |
| 附录Ⅰ 相关载体图谱 | 第81-85页 |
| 附录Ⅱ A29菌丝体接合转移原始数据 | 第85-88页 |
| 附录Ⅲ A29和xzqh12 AHBA合酶基因序列 | 第88-91页 |
| 附录Ⅳ 基于PCR targeting的基因敲除原理示意图 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-100页 |
| 致谢 | 第100-101页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第101页 |
