| 摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-15页 |
| 论文创新点 | 第16-17页 |
| 研究意义 | 第17-18页 |
| 技术路线 | 第18-19页 |
| 第一部分 文献综述 | 第19-56页 |
| 第一章 猪圆环病毒2型研究进展 | 第19-41页 |
| 1 猪圆环病毒的分类学地位 | 第19-20页 |
| 2 猪圆环病毒的生物学特性 | 第20-21页 |
| 3 猪圆环病毒基因组结构 | 第21-23页 |
| 4 猪圆环病毒基因组的编码产物及其功能 | 第23-29页 |
| 4.1 Rep蛋白和Rep'蛋白 | 第24-25页 |
| 4.2 Cap蛋白 | 第25-27页 |
| 4.3 ORF3蛋白 | 第27-28页 |
| 4.4 ORF4蛋白 | 第28-29页 |
| 5 猪圆环病毒生活周期 | 第29-33页 |
| 5.1 病毒的吸附和胞吞 | 第29-31页 |
| 5.2 病毒的复制与转录 | 第31-33页 |
| 6 猪圆环病毒编码蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用 | 第33-36页 |
| 6.1 与Rep蛋白互作的宿主蛋白 | 第33-34页 |
| 6.2 与Cap蛋白互作的宿主蛋白 | 第34-35页 |
| 6.3 与ORF3蛋白互作的宿主蛋白 | 第35-36页 |
| 7 猪圆环病毒2型的致病机理分析 | 第36-41页 |
| 7.1 免疫系统的破坏 | 第36-38页 |
| 7.2 PCV2 DNA对免疫系统的影响 | 第38-39页 |
| 7.3 PCV2诱导的细胞凋亡和细胞自噬 | 第39-41页 |
| 第二章 病毒胞内运输机制的研究进展 | 第41-56页 |
| 1 微管系统的组成和功能 | 第41-47页 |
| 1.1 微管的组成和功能 | 第41-44页 |
| 1.2 微管的分子马达和功能 | 第44-47页 |
| 1.2.1 动力蛋白的结构和功能 | 第45-46页 |
| 1.2.2 驱动蛋白的组成和功能 | 第46-47页 |
| 2 微管运输系统的运行机制 | 第47-56页 |
| 2.1 微管与细胞内物质运输 | 第47-48页 |
| 2.2 病毒的胞内运输 | 第48-56页 |
| 2.2.1 微管在病毒胞内运输中的功能 | 第49-50页 |
| 2.2.2 分子马达在病毒胞内运输中的功能 | 第50-56页 |
| 第二部分 研究内容 | 第56-118页 |
| 第一章 微管在PCV2感染中的功能分析 | 第56-80页 |
| 摘要 | 第56-57页 |
| 1 材料 | 第57-59页 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞 | 第57-58页 |
| 1.2 载体、试剂、抗体和仪器 | 第58-59页 |
| 2 实验方法 | 第59-64页 |
| 2.1 药物(或蛋白)处理和病毒接种 | 第59页 |
| 2.2 细胞活性检测试验 | 第59-60页 |
| 2.3 BCA方法测定蛋白浓度 | 第60页 |
| 2.4 通过间接免疫荧光方法(IFA)测定病毒TCID50 | 第60-61页 |
| 2.5 SDS-PAGE电泳及Western-blot | 第61-62页 |
| 2.6 普通激光共聚焦显微镜和超高分辨率激光共聚焦显微镜分析 | 第62-63页 |
| 2.7 人源HDAC6基因的克隆和兔多抗的制备 | 第63-64页 |
| 3. 结果 | 第64-77页 |
| 3.1 微管聚合功能破坏对PCV2感染增殖的影响 | 第64-65页 |
| 3.2 微管在PCV2的核靶向运输活动中的功能分析 | 第65-69页 |
| 3.3 入侵的PCV2与早期内涵体的定位关系 | 第69-71页 |
| 3.4 HDAC6基因的克隆和兔多抗的制备 | 第71-73页 |
| 3.5 微管乙酰化水平调节对PCV2感染增殖的影响 | 第73-75页 |
| 3.6 PCV2 Cap蛋白对微管乙酰化水平的调节 | 第75-77页 |
| 4 讨论 | 第77-80页 |
| 4.1 PCV2的正常感染过程依赖微管的正常聚合功能 | 第77页 |
| 4.2 微管为PCV2的核靶向运输提供轨道 | 第77-79页 |
| 4.3 PCV2的感染可能通过促进α-tubulin乙酰化来稳定微管功能 | 第79-80页 |
| 第二章 分子马达dynein在PCV2感染中的功能分析 | 第80-99页 |
| 摘要 | 第80-81页 |
| 1 材料 | 第81-82页 |
| 1.1 病毒和细胞 | 第81页 |
| 1.2 载体、试剂、抗体和仪器 | 第81-82页 |
| 2 实验方法 | 第82-85页 |
| 2.1 药物处理和病毒接种 | 第82页 |
| 2.2 相关基因的克隆、表达载体的构建以及兔多抗的制备 | 第82-83页 |
| 2.3 Dynein活性破坏对PCV2感染早期病毒颗粒胞内运输效率的影响 | 第83页 |
| 2.4 PCV2感染早期病毒颗粒与分子马达dynein亚基的亚细胞定位关系 | 第83页 |
| 2.5 PCV2感染中晚期衣壳蛋白与dynein的IC1亚基的亚细胞定位关系 | 第83页 |
| 2.6 外源性表达PCV2编码蛋白及其突变体与IC1蛋白的亚细胞定位关系 | 第83-84页 |
| 2.7 胞核和胞质组分抽提和SDS-WB鉴定 | 第84-85页 |
| 3 结果 | 第85-95页 |
| 3.1 Dynein的活性破坏对PCV2感染增殖的影响 | 第85-87页 |
| 3.2 在核靶向运输过程中PCV2对dynein各亚基的募集作用分析 | 第87-89页 |
| 3.3 在PCV2感染的PK15细胞中dynein-IC1亚基的亚细胞定位变化 | 第89-91页 |
| 3.4 在PCV2感染的3D4/31细胞中dynein-IC1亚基的亚细胞定位变化 | 第91-92页 |
| 3.5 引起dynein-IC1亚基亚细胞定位变化的单因素分析 | 第92-95页 |
| 4 讨论 | 第95-99页 |
| 4.1 Dynein是PCV2核靶向运输的分子马达 | 第95-96页 |
| 4.2 内源性Dynein-IC1亚基与Cap蛋白的动态共定位 | 第96-97页 |
| 4.3 PCV2 Cap蛋白介导dynein的IC1亚基发生异常核定位 | 第97-99页 |
| 第三章 Dynein-IC1与PCV2-Cap的相互作用及功能研究 | 第99-118页 |
| 摘要 | 第99-100页 |
| 1 材料 | 第100页 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞 | 第100页 |
| 1.2 载体、试剂、抗体和仪器 | 第100页 |
| 2 实验方法 | 第100-106页 |
| 2.1 原核表达 | 第100-101页 |
| 2.2 GST-pulldown | 第101-102页 |
| 2.3 真核表达质粒构建 | 第102页 |
| 2.4 免疫共沉淀 | 第102-103页 |
| 2.5 有效shRNA的设计和RNAi细胞系的构建 | 第103-104页 |
| 2.5.1 有效shRNA的设计和筛选 | 第103页 |
| 2.5.2 慢病毒介导的shRNA干扰细胞系构建 | 第103-104页 |
| 2.6 IC1基因的RNAi对PCV2复制及早期胞内运输的影响 | 第104-106页 |
| 2.6.1 IC1基因的RNAi对PCV2滴度的影响 | 第104页 |
| 2.6.2 IC1基因的RNAi对PCV2基因组拷贝数的影响 | 第104-105页 |
| 2.6.3 IC1基因的RNAi对PCV2编码基因转录水平的影响 | 第105-106页 |
| 2.6.4 IC1基因的RNAi对PCV2感染早期胞内运输的影响 | 第106页 |
| 3 结果 | 第106-115页 |
| 3.1 PCV2的Cap蛋白与IC1在病毒感染细胞中的互作关系分析 | 第106-107页 |
| 3.2 PCV2的Cap蛋白与IC1的体外互作关系分析 | 第107-108页 |
| 3.3 质粒共转分析外源性表达蛋白的互作关系 | 第108-109页 |
| 3.4 PCV2的Cap蛋白中IC1结合区域的鉴定 | 第109-112页 |
| 3.5 IC1的RNAi细胞系的建立 | 第112-114页 |
| 3.6 IC1蛋白表达敲降对PCV2感染增殖的影响 | 第114-115页 |
| 3.7 IC1蛋白表达敲降对PCV2核靶向运输活动的影响 | 第115页 |
| 4 讨论 | 第115-118页 |
| 4.1 Cap与IC1在体内和体外都存在相互作用 | 第116页 |
| 4.2 Cap与IC1相互作用的生物学意义 | 第116-118页 |
| 全文总结 | 第118-120页 |
| 展望 | 第120-121页 |
| 参考文献 | 第121-131页 |
| 第三部分 附录 | 第131-139页 |
| 附录A 本文涉及的引物及重组质粒 | 第131-133页 |
| 附录B 全文缩略语 | 第133-135页 |
| 附录C 常用缓冲液及配方 | 第135-139页 |
| 致谢 | 第139-140页 |
| 作者简历 | 第140页 |
