| 论文创新点 | 第12-13页 |
| 摘要 | 第13-15页 |
| ABSTRACT | 第15-16页 |
| 研究意义 | 第17-18页 |
| 技术路线 | 第18-19页 |
| 第一部分 文献综述 | 第19-49页 |
| 第一章 病毒感染与宿主抗病毒免疫研究进展 | 第19-37页 |
| 1 先天免疫在抗病毒反应过程中的作用 | 第19-30页 |
| 1.1 干扰素抗病毒作用的机制 | 第20-21页 |
| 1.2 病毒感染诱导宿主产生IFN-α/β的过程 | 第21-25页 |
| 1.2.1 RLR通路 | 第21-23页 |
| 1.2.2 TLR通路 | 第23-25页 |
| 1.3 宿主对RLR通路介导IFN-β表达的调控机制 | 第25-30页 |
| 1.3.1 泛素化修饰对于RLR抗病毒信号的调控 | 第26-28页 |
| 1.3.2 去泛素化酶对RLR抗病毒信号的调控 | 第28-29页 |
| 1.3.3 磷酸化修饰对于RLR抗病毒信号的调控 | 第29-30页 |
| 1.3.4 Ⅰ型干扰素的正反馈调节作用 | 第30页 |
| 2 病毒逃逸先天免疫抗病毒反应的策略 | 第30-33页 |
| 2.1 病毒抑制诱导IFN产生的信号 | 第30-31页 |
| 2.2 病毒广泛抑制宿主蛋白的表达 | 第31-32页 |
| 2.3 病毒抑制IFN下游信号的转导 | 第32页 |
| 2.4 病毒抑制IFN诱导产生的抗病毒蛋白活性 | 第32页 |
| 2.5 病毒蛋白劫持宿主泛素系统的功能 | 第32-33页 |
| 3 禽类抗病毒免疫相关模式识别受体 | 第33-37页 |
| 3.1 禽类TLR3、7、15、21 | 第33-35页 |
| 3.2 禽类RLRs | 第35-37页 |
| 第二章 IBDV致病机制的研究进展 | 第37-49页 |
| 1 IBDV简介 | 第37-44页 |
| 1.1 IBDV的基因组特点 | 第38-39页 |
| 1.2 IBDV编码的蛋白 | 第39-44页 |
| 1.2.1 VP1蛋白 | 第39-40页 |
| 1.2.2 VP2蛋白 | 第40-41页 |
| 1.2.3 VP3蛋白 | 第41-42页 |
| 1.2.4 VP4蛋白 | 第42-43页 |
| 1.2.5 VP5蛋白 | 第43-44页 |
| 2 IBDV侵入宿主细胞的机制 | 第44-46页 |
| 2.1 病毒侵入宿主的方式 | 第44页 |
| 2.2 IBDV的细胞受体 | 第44-46页 |
| 2.2.1 鸡B淋巴细胞受体 | 第45页 |
| 2.2.2 成纤维细胞受体 | 第45页 |
| 2.2.3 其他细胞受体 | 第45-46页 |
| 3 IBD导致免疫抑制的机制 | 第46-49页 |
| 第二部分 研究内容 | 第49-118页 |
| 第一章 鸡MAVS的克隆及功能分析 | 第49-73页 |
| 摘要 | 第49-50页 |
| 1 材料 | 第50-51页 |
| 1.1 主要仪器与器材 | 第50页 |
| 1.2 试剂、细胞、毒株和实验动物 | 第50-51页 |
| 2 方法 | 第51-60页 |
| 2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备 | 第51页 |
| 2.2 总RNA的抽提和反转录反应 | 第51-52页 |
| 2.3 感受态细胞的制备 | 第52-53页 |
| 2.4 转化 | 第53页 |
| 2.5 DNA片段的回收 | 第53页 |
| 2.6 T-A克隆和序列测定 | 第53-54页 |
| 2.7 半定量RT-PCR及光密度分析 | 第54-55页 |
| 2.8 生物信息学软件对鸡MAVS结构域的预测 | 第55页 |
| 2.9 鸡MAVS真核表达载体及结构域缺失突变体的构建 | 第55页 |
| 2.10 共表达载体的构建 | 第55-56页 |
| 2.11 SDS-PAGE及Western blot分析 | 第56页 |
| 2.12 质粒抽提 | 第56-57页 |
| 2.13 RNA干扰 | 第57页 |
| 2.14 转染与激光共聚焦观察 | 第57-58页 |
| 2.15 间接免疫荧光(IFA) | 第58页 |
| 2.16 荧光素酶报告基因实验 | 第58页 |
| 2.17 胞内Poly(I：C)刺激和荧光定量PCR(qRT-PCR)实验 | 第58-59页 |
| 2.18 病毒滴度的测定 | 第59页 |
| 2.19 统计学分析 | 第59-60页 |
| 3 结果 | 第60-70页 |
| 3.1 鸡MAVS的克隆、序列测定和生物信息学分析 | 第60-62页 |
| 3.2 鸡MAVS与其他物种MAVS的同源性及进化分析 | 第62-63页 |
| 3.3 chMAVS的亚细胞定位 | 第63-65页 |
| 3.4 chMAVS在chIFN-β诱生过程中的作用 | 第65-67页 |
| 3.5 chMAVS各结构域对chIFN-β表达的影响 | 第67-68页 |
| 3.6 chMAVS介导chIFN-β的诱生不需要IRF3的入核 | 第68-70页 |
| 3.7 chMAVS具有抗IBDV的功能 | 第70页 |
| 4 讨论 | 第70-73页 |
| 第二章 IBDV感染对宿主细胞·型干扰素系统的影响 | 第73-95页 |
| 摘要 | 第73-74页 |
| 1 材料 | 第74-75页 |
| 1.1 主要仪器与器材 | 第74页 |
| 1.2 试剂、细胞、毒株和实验动物 | 第74-75页 |
| 2 方法 | 第75-80页 |
| 2.1 IBDV病毒的扩大培养与病毒基因组dsRNA的抽提 | 第75-76页 |
| 2.2 IBDV热灭活条件的摸索 | 第76页 |
| 2.3 胞内dsRNA刺激实验 | 第76页 |
| 2.4 鸡IFN-α/β预处理DF-1细胞实验 | 第76页 |
| 2.5 SDS-PAGE和Western-blot分析 | 第76-77页 |
| 2.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验 | 第77页 |
| 2.7 鸡MDA5基因的克隆、生物信息学分析及相关表达载体的构建 | 第77-78页 |
| 2.8 IBDV基因组dsRNA的生物素标记 | 第78页 |
| 2.9 dsRNA pulldown实验 | 第78-79页 |
| 2.10 RNA干扰 | 第79页 |
| 2.11 病毒滴度的测定 | 第79页 |
| 2.12 统计学分析 | 第79-80页 |
| 3 结果 | 第80-92页 |
| 3.1 鸡Ⅰ型干扰素预处理DF-1细胞后显著抑制IBDV的胞内复制 | 第80-82页 |
| 3.2 IBDV感染不能诱导DF-1细胞上调表达Ⅰ型干扰素 | 第82-83页 |
| 3.3 IBDV病毒蛋白与鸡MAVS不存在共定位 | 第83-84页 |
| 3.4 chIFN-α/β预处理增强IBDV感染DF-1细胞后chIFN-β的表达 | 第84-86页 |
| 3.5 IBDV基因组dsRNA是一种PAMP | 第86-88页 |
| 3.6 鸡MDA5的克隆及有效shRNA的筛选和稳定干扰细胞的建立 | 第88-89页 |
| 3.7 鸡胞内模式识别受体MDA5介导DF-1细胞对IBDV基因组dsRNA的识别 | 第89-92页 |
| 4 讨论 | 第92-95页 |
| 第三章 VP3阻断宿主细胞干扰素-β表达的机制研究 | 第95-118页 |
| 摘要 | 第95-96页 |
| 1 材料 | 第96-97页 |
| 1.1 主要仪器与器材 | 第96-97页 |
| 1.2 试剂、细胞、毒株和实验动物 | 第97页 |
| 2 方法 | 第97-101页 |
| 2.1 IFA | 第97-98页 |
| 2.2 半定量RT-PCR | 第98页 |
| 2.3 SDS-PAGE和Western-blot分析 | 第98页 |
| 2.4 病毒蛋白诱导表达系统的构建 | 第98页 |
| 2.5 pCMV-Flag-VP1～5及VP3突变载体的构建 | 第98-100页 |
| 2.6 VP3和VP4的原核表达 | 第100页 |
| 2.7 IBDV基因组dsRNA的抽提及其生物素标记 | 第100页 |
| 2.8 VP3和chMDA5竞争结合IBDV基因组dsRNA实验 | 第100页 |
| 2.9 qRT-PCR实验 | 第100-101页 |
| 2.10 免疫共沉淀实验 | 第101页 |
| 2.11 统计学分析 | 第101页 |
| 3 结果 | 第101-115页 |
| 3.1 筛选阻断dsRNA诱导chIFN-β表达的IBDV病毒蛋白 | 第101-102页 |
| 3.2 构建病毒蛋白VP1～5的诱导表达系统 | 第102-105页 |
| 3.3 过表达VPs对胞内dsRNA刺激上调chIFN-β表达的影响 | 第105-107页 |
| 3.4 VP3可结合dsRNA | 第107-108页 |
| 3.5 K_(99)R_(102)K_(105)K_(106)共同负责VP3结合dsRNA的功能 | 第108-110页 |
| 3.6 VP3阻断胞内dsRNA诱导的chIFN-β上调表达与其dsRNA结合能力有关 | 第110-112页 |
| 3.7 VP3与chMDA5竞争结合IBDV基因组dsRNA | 第112-115页 |
| 3.8 VP3和chMDA5不存在相互作用 | 第115页 |
| 4 讨论 | 第115-118页 |
| 全文总结 | 第118-119页 |
| 参考文献 | 第119-137页 |
| 第三部分 附录 | 第137-149页 |
| 附录A 全文缩略语 | 第137-140页 |
| 附录B 常用缓冲液及培养基配方 | 第140-148页 |
| 附录C 攻读博士期间学术成果 | 第148-149页 |
| 致谢 | 第149页 |
