| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-18页 |
| 1 阿魏酸酯酶的种类 | 第10页 |
| 2 阿魏酸酯酶的结构与催化机理 | 第10-11页 |
| 3 阿魏酸酯酶的理化性质 | 第11页 |
| 4 自然界中能够分泌阿魏酸酯酶的微生物种类 | 第11-12页 |
| 5 阿魏酸酯酶基因的克隆表达与重组 | 第12-13页 |
| 6 阿魏酸酯酶的酶活测定 | 第13-14页 |
| 7 阿魏酸酯酶的广泛应用 | 第14-16页 |
| 8 阿魏酸酯酶的研究现状 | 第16页 |
| 9 论文研究的目的、意义及主要内容 | 第16-18页 |
| 9.1 研究的意义和目的 | 第16-17页 |
| 9.2 研究的主要内容 | 第17-18页 |
| 第二章 海栖热袍菌来源的极耐热性阿魏酸酯酶的鉴定 | 第18-35页 |
| 1 材料 | 第18-23页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第18页 |
| 1.2 培养基 | 第18-21页 |
| 1.3 培养条件 | 第21页 |
| 1.4 主要试剂及其来源 | 第21-22页 |
| 1.5 主要设备及其来源 | 第22-23页 |
| 2 方法 | 第23-29页 |
| 2.1 感受态细胞的制备 | 第23页 |
| 2.2 电转化 | 第23页 |
| 2.3 DNA酶切反应、磷酸化反应、连接反应及核酸浓缩 | 第23-24页 |
| 2.4 质粒的提取 | 第24页 |
| 2.5 海栖热袍菌的厌氧瓶液体培养 | 第24页 |
| 2.6 基因组DNA的提取 | 第24-25页 |
| 2.7 引物设计 | 第25页 |
| 2.8 目的基因fae的扩增 | 第25页 |
| 2.9 重组表达质粒pHsh-fae的构建 | 第25-26页 |
| 2.10 重组表达质粒mRNA二级结构的优化 | 第26页 |
| 2.11 重组菌的培养及重组酶的鉴定 | 第26-27页 |
| 2.12 重组阿魏酸酯酶的诱导表达 | 第27页 |
| 2.13 粗酶液的制备 | 第27页 |
| 2.14 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第27-28页 |
| 2.15 重组阿魏酸酯酶的酶活测定方法 | 第28-29页 |
| 3 结果与分析 | 第29-33页 |
| 3.1 目的基因的克隆 | 第29-30页 |
| 3.2 重组表达质粒二级结构的优化 | 第30-31页 |
| 3.3 重组酶的阿魏酸酯酶活性的鉴定 | 第31-32页 |
| 3.4 重组阿魏酸酯酶的表达及酶活检测 | 第32-33页 |
| 4 讨论 | 第33-35页 |
| 第三章 利用原位易错PCR构建随机突变文库——定向筛选高效表达菌株 | 第35-44页 |
| 1 材料 | 第36-38页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第36页 |
| 1.2 培养基 | 第36页 |
| 1.3 培养条件 | 第36页 |
| 1.4 主要试剂及其来源 | 第36-37页 |
| 1.5 主要设备及其来源 | 第37-38页 |
| 2 方法 | 第38-41页 |
| 2.1 一般基因操作方法 | 第38页 |
| 2.2 通过原位易错PCR构建突变文库的原理 | 第38-39页 |
| 2.3 构建随机突变文库的“超大引物”的制备方法 | 第39-40页 |
| 2.4 通过原位易错PCR构建随机突变文库的方法 | 第40页 |
| 2.5 转化与转化子筛选 | 第40页 |
| 2.6 酶活测定 | 第40-41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-43页 |
| 3.1 构建突变文库用的“超大引物”制备 | 第41页 |
| 3.2 阿魏酸酯酶基因随机突变文库的构建与高通量筛选 | 第41-43页 |
| 3.3 筛选的突变子阿魏酸酯酶的表达及检测 | 第43页 |
| 4 讨论 | 第43-44页 |
| 第四章 利用酵母系统分泌性表达阿魏酸酯酶 | 第44-53页 |
| 1 材料 | 第44-47页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第44-45页 |
| 1.2 培养基 | 第45页 |
| 1.3 培养条件 | 第45页 |
| 1.4 主要试剂及其来源 | 第45-46页 |
| 1.5 主要设备及其来源 | 第46-47页 |
| 2 方法 | 第47-50页 |
| 2.1 一般基因操作方法 | 第47页 |
| 2.2 裂殖酵母感受态细胞的制备和醋酸锂转化 | 第47-48页 |
| 2.3 分泌型表达质粒pADH-GFAT-cpy-fae的构建 | 第48-49页 |
| 2.4 pADH-GFAT-cpy-fae质粒的转化与表达 | 第49页 |
| 2.5 粗酶提取与酶活测定 | 第49-50页 |
| 2.6 阿魏酸酯酶表达的SDS-PAGE | 第50页 |
| 3 结果与分析 | 第50-51页 |
| 3.1 质粒pADH-GFAT-cpy-fae的构建 | 第50-51页 |
| 3.2 阿魏酸酯酶酶的SDS-PAGE检测及酶活检测 | 第51页 |
| 4 讨论 | 第51-53页 |
| 第五章 结论 | 第53-55页 |
| 参考文献 | 第55-63页 |
| 致谢 | 第63页 |
