| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 前言 | 第10-19页 |
| 一、烟碱类杀虫剂及噻虫啉的概述 | 第10页 |
| 二、烟碱类杀虫剂THI的代谢途径研究 | 第10-12页 |
| 1 THI在植物和动物中的代谢 | 第10-11页 |
| 2 THI在土壤中的代谢 | 第11-12页 |
| 三、腈水合酶的研究 | 第12-14页 |
| 四、Variovorax的国内外研究现状 | 第14-17页 |
| 五、本论文的研究思路 | 第17-19页 |
| 第二章 V. boronicumulans CGMCC 4969腈水合酶基因及激活蛋白的克隆表达和酶活检测 | 第19-50页 |
| 第一节 V. boronicumulans CGMCC 4969腈水合酶基因及激活蛋白基因原核表达载体的构建 | 第19-36页 |
| 1 实验材料 | 第19-22页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第19页 |
| 1.2 培养基的配制 | 第19-20页 |
| 1.3 主要试剂及来源 | 第20页 |
| 1.4 主要仪器设备及其来源 | 第20页 |
| 1.5 主要溶液配制 | 第20-21页 |
| 1.6 酶和试剂盒 | 第21页 |
| 1.7 PCR引物 | 第21-22页 |
| 1.8 菌株保藏 | 第22页 |
| 2 实验方法 | 第22-31页 |
| 2.1 基因组DNA的提取 | 第22页 |
| 2.2 设计引物进行PCR扩增 | 第22-28页 |
| 2.2.1 TNHase(TnhA+TnhB)基因的克隆 | 第22-23页 |
| 2.2.2 TnhC基因的克隆 | 第23页 |
| 2.2.3 TNHase(TnhA+TnhB)+TnhC基因的克隆 | 第23-24页 |
| 2.2.4 TnhC+TNHase(TnhA+TnhB)基因的克隆 | 第24-26页 |
| 2.2.5 TnhC+SD序列+TNHase(TnhA+TnhB)基因的克隆 | 第26-28页 |
| 2.3 琼脂糖凝胶电泳 | 第28页 |
| 2.4 PCR产物回收 | 第28页 |
| 2.5 PCR产物装TA克隆 | 第28页 |
| 2.6 CaCl_2法制备感受态细胞 | 第28-29页 |
| 2.7 感受态细胞的热休克转化和稀释涂布 | 第29页 |
| 2.8 克隆载体的阳性筛选 | 第29-30页 |
| 2.9 表达载体的阳性筛选 | 第30-31页 |
| 3 实验结果 | 第31-35页 |
| 4 讨论 | 第35-36页 |
| 第二节 V. boronicumulans CGMCC 4969腈水合酶基因及激活蛋白基因在大肠杆菌中的表达 | 第36-42页 |
| 1 实验材料 | 第36-38页 |
| 1.1 菌种和质粒 | 第36页 |
| 1.2 培养基的配制 | 第36页 |
| 1.3 主要试剂及来源 | 第36-37页 |
| 1.4 主要仪器设备及其来源 | 第37页 |
| 1.5 主要溶液配制 | 第37-38页 |
| 2 实验方法 | 第38-41页 |
| 2.1 目的蛋白的诱导表达 | 第38-39页 |
| 2.2 SDS-PAGE检测蛋白表达 | 第39-40页 |
| 2.3 Western blot检测目的蛋白的表达情况 | 第40-41页 |
| 3 实验结果 | 第41-42页 |
| 4 讨论 | 第42页 |
| 第三节 V. boronicumulans CGMCC 4969腈水合酶及激活蛋白的酶活性测定分析 | 第42-50页 |
| 1 实验材料 | 第42-43页 |
| 1.1 菌种和质粒 | 第42页 |
| 1.2 培养基的配制 | 第42-43页 |
| 1.3 主要试剂及来源 | 第43页 |
| 1.4 主要仪器设备及其来源 | 第43页 |
| 2 实验方法 | 第43-44页 |
| 2.1 目的蛋白的诱导表达 | 第43页 |
| 2.2 静息细胞转化噻虫啉 | 第43-44页 |
| 2.3 高效液相色谱(HPLC)分析 | 第44页 |
| 2.4 THI土壤半衰期 | 第44页 |
| 3 结果 | 第44-49页 |
| 3.1 蛋白表达宿主菌的优化 | 第44-46页 |
| 3.2 静息细胞转化条件的优化 | 第46-47页 |
| 3.2.1 pH的优化 | 第46页 |
| 3.2.2 温度的优化 | 第46页 |
| 3.2.3 CoCl_2浓度的优化 | 第46-47页 |
| 3.3 不同质粒表达的TNHase的活性 | 第47-48页 |
| 3.4 重组表达的TNHase的底物特异性 | 第48-49页 |
| 4 讨论 | 第49-50页 |
| 第三章 腈水合酶重组表达菌株转化3-氰基吡啶研究 | 第50-56页 |
| 1 实验材料 | 第50-51页 |
| 1.1 菌种和质粒 | 第50页 |
| 1.2 培养基的配制 | 第50页 |
| 1.3 主要试剂及来源 | 第50-51页 |
| 1.4 主要仪器设备及其来源 | 第51页 |
| 2 实验方法 | 第51-52页 |
| 2.1 目的蛋白的诱导表达 | 第51页 |
| 2.2 静息细胞转化3-氰基吡啶 | 第51-52页 |
| 2.3 高效液相色谱(HPLC)分析 | 第52页 |
| 3 结果 | 第52-55页 |
| 3.1 静息细胞转化3-氰基吡啶结果 | 第52-53页 |
| 3.2 蛋白表达条件和发酵条件的优化 | 第53-55页 |
| 3.2.1 蛋白表达宿主菌的优化 | 第53页 |
| 3.2.2 诱导剂种类和浓度,诱导时机及Co~(2+)浓度的优化 | 第53页 |
| 3.2.3 发酵条件的优化 | 第53-55页 |
| 3.3 酶活性的检测 | 第55页 |
| 4 讨论 | 第55-56页 |
| 总结 | 第56-57页 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
