| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 缩略语 | 第13-14页 |
| 前言 | 第14-16页 |
| 上篇 文献综述 | 第16-32页 |
| 第一章 瞬时受体电位(TRP)钙离子通道在骨稳态中的作用 | 第16-32页 |
| 1 细胞外钙稳态的调节及对骨稳态的作用 | 第17-19页 |
| 2 骨细胞内的钙离子信号系统 | 第19-20页 |
| 2.1 破骨细胞内的钙信号系统 | 第19页 |
| 2.2 软骨细胞内的钙信号系统 | 第19页 |
| 2.3 成骨细胞内的钙信号系统 | 第19-20页 |
| 3 TRP通道在骨生物学中的作用 | 第20-26页 |
| 3.1 TRPV6 | 第21页 |
| 3.2 TRPV5 | 第21-22页 |
| 3.3 TPV4 | 第22-24页 |
| 3.4 TPV2 | 第24页 |
| 3.5 TRPV1 | 第24-26页 |
| 参考文献 | 第26-32页 |
| 下篇 试验研究 | 第32-78页 |
| 第二章 鸡TRPV6基因RNA干扰质粒的构建 | 第32-44页 |
| 摘要 | 第32-33页 |
| 1 材料与方法 | 第33-37页 |
| 1.1 主要仪器 | 第33页 |
| 1.2 主要试剂 | 第33页 |
| 1.3 TRPV6特异性siRNA序列的设计 | 第33-34页 |
| 1.4 shRNA序列DNA模板的设计 | 第34-35页 |
| 1.5 shRNA与pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体的连接 | 第35页 |
| 1.5.1 两条shRNA的DNA单链退火形成双链shRNA | 第35页 |
| 1.5.2 链shRNA与pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体的连接 | 第35页 |
| 1.6 转化及扩增重组质粒 | 第35-36页 |
| 1.7 按碱裂解法抽提重组质粒 | 第36-37页 |
| 1.8 质粒的酶切与测序鉴定 | 第37页 |
| 1.8.1 重组质粒的酶切鉴定 | 第37页 |
| 1.8.2 重组质粒的测序鉴定 | 第37页 |
| 2 结果 | 第37-39页 |
| 2.1 重组质粒的酶切鉴定 | 第37-38页 |
| 2.2 重组质粒的测序鉴定 | 第38-39页 |
| 3 讨论 | 第39-40页 |
| 4 小结 | 第40-41页 |
| 参考文献 | 第41-43页 |
| ABSTRACT | 第43-44页 |
| 第三章 TRPV6 RNA干扰质粒对成骨细胞TRPV6表达的沉默效果 | 第44-58页 |
| 摘要 | 第44-45页 |
| 1 材料与方法 | 第45-51页 |
| 1.1 主要仪器 | 第45页 |
| 1.2 主要试剂 | 第45页 |
| 1.3 成骨细胞培养 | 第45-46页 |
| 1.4 高纯度无内毒素质粒的提取 | 第46页 |
| 1.5 成骨细胞转染 | 第46-47页 |
| 1.5.1 脂质体转染 | 第47页 |
| 1.5.2 荧光倒置显微镜检测转染效率 | 第47页 |
| 1.6 Real-time PCR检测TRPV6基因mRNA表达 | 第47-48页 |
| 1.6.1 成骨细胞RNA的提取 | 第47页 |
| 1.6.2 总RNA的定量 | 第47-48页 |
| 1.6.3 RNA逆转录成cDNA | 第48页 |
| 1.6.4 引物的设计与合成 | 第48页 |
| 1.6.5 实时定量PCR | 第48页 |
| 1.7 Western-blot检测成骨细胞中TRPV6蛋白表达 | 第48-50页 |
| 1.7.1 主要溶液 | 第48-49页 |
| 1.7.2 细胞蛋白的提取 | 第49页 |
| 1.7.3 蛋白质含量的测定 | 第49页 |
| 1.7.4 样品的处理 | 第49-50页 |
| 1.7.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第50页 |
| 1.7.6 转印 | 第50页 |
| 1.7.7 免疫反应 | 第50页 |
| 1.7.8 化学发光反应 | 第50页 |
| 1.7.9 拍照和分析 | 第50页 |
| 1.8 数据分析与统计 | 第50-51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-54页 |
| 2.1 成骨细胞碱性磷酸酶染色鉴定 | 第51页 |
| 2.2 成骨细胞的转染效率 | 第51-52页 |
| 2.3 转染48h后成骨细胞TRPV6的mRNA表达水平 | 第52-53页 |
| 2.4 转染48h后成骨细胞TRPV6基因的蛋白表达水平 | 第53-54页 |
| 3 讨论 | 第54-55页 |
| 4 小结 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-57页 |
| ABSTRACT | 第57-58页 |
| 第四章 沉默TRPV6对成骨细胞钙转运基因表达的影响 | 第58-68页 |
| 摘要 | 第58-59页 |
| 1 材料与方法 | 第59-61页 |
| 1.1 主要仪器 | 第59页 |
| 1.2 主要试剂 | 第59页 |
| 1.3 成骨细胞的培养 | 第59页 |
| 1.4 高纯度无内毒素质粒的提取 | 第59页 |
| 1.5 成骨细胞转染 | 第59页 |
| 1.6 Real-time PCR分析 | 第59-61页 |
| 1.6.1 成骨细胞RNA的提取 | 第60页 |
| 1.6.2 总RNA的定量 | 第60页 |
| 1.6.3 RNA逆转录成cDNA | 第60页 |
| 1.6.4 引物的设计与合成 | 第60页 |
| 1.6.5 实时定量PCR | 第60-61页 |
| 1.6.6 成骨细胞中钙转运基因mRNA表达量的测定 | 第61页 |
| 1.7 Western-blot分析 | 第61页 |
| 1.8 数据分析和统计 | 第61页 |
| 2 结果与分析 | 第61-63页 |
| 2.1 沉默TRPV6基因对calbindin-D28K、PMCAlb和NCX1 mRNA表达水平的影响 | 第61-62页 |
| 2.2 沉默TRPV6基因对calbindin-D28K蛋白表达水平的影响 | 第62-63页 |
| 3 讨论 | 第63-64页 |
| 4 小结 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-66页 |
| ABSTRACT | 第66-68页 |
| 第五章 沉默TRPV6对成骨细胞OPG和RANKL基因表达的影响 | 第68-78页 |
| 摘要 | 第68-69页 |
| 1 材料与方法 | 第69-70页 |
| 1.1 主要仪器 | 第69页 |
| 1.2 主要试剂 | 第69页 |
| 1.3 成骨细胞的培养 | 第69页 |
| 1.4 高纯度无内毒素质粒的提取 | 第69页 |
| 1.5 成骨细胞的转染 | 第69页 |
| 1.6 Real-time PCR分析 | 第69-70页 |
| 1.7 Western-blot分析 | 第70页 |
| 1.8 数据分析和统计 | 第70页 |
| 2 结果与分析 | 第70-72页 |
| 2.1 沉默TRPV6基因对OPG和RANKL mRNA表达水平的影响 | 第70-71页 |
| 2.2 沉默TRPV6基因对RANKL蛋白表达水平的影响 | 第71-72页 |
| 3 讨论 | 第72-73页 |
| 4 小结 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-76页 |
| ABSTRACT | 第76-78页 |
| 全文结论 | 第78-80页 |
| 论文创新之处 | 第80-82页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 | 第82-84页 |
| 致谢 | 第84页 |
