| 导师评阅表 | 第3-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| 英文摘要 | 第7页 |
| 英文缩写词表 | 第11-12页 |
| 前言 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-23页 |
| 1.1 极端微生物 | 第13页 |
| 1.2 高温蛋白酶研究概述 | 第13-16页 |
| 1.2.1 蛋白酶的分类与命名 | 第14-15页 |
| 1.2.2 蛋白酶基因克隆与表达 | 第15-16页 |
| 1.3 高温蛋白酶的功能和应用 | 第16-17页 |
| 1.3.1 高温蛋白酶的功能 | 第16页 |
| 1.3.2 高温蛋白酶在工业生产中的应用 | 第16-17页 |
| 1.4 蛋白酶的作用机制 | 第17-20页 |
| 1.4.1 丝氨酸蛋白酶 | 第18-19页 |
| 1.4.2 天冬氨酸蛋白酶 | 第19页 |
| 1.4.3 半胱氨酸蛋白酶 | 第19-20页 |
| 1.4.4 金属蛋白酶 | 第20页 |
| 1.5 产蛋白酶菌株的选育 | 第20-22页 |
| 1.5.1 诱变选育 | 第21页 |
| 1.5.2 原生质体融合育种 | 第21页 |
| 1.5.3 基因工程育种 | 第21-22页 |
| 1.5.4 蛋白质工程选育高产菌株 | 第22页 |
| 1.6 本研究的目的意义 | 第22-23页 |
| 第二章 产高温蛋白酶菌株的分离筛选与鉴定 | 第23-29页 |
| 2.1 试验材料 | 第23页 |
| 2.2 主要仪器设备 | 第23页 |
| 2.3 试验方法 | 第23-24页 |
| 2.3.1 土壤中微生物的分离纯化 | 第23页 |
| 2.3.2 产高温蛋白酶菌株的筛选(透明圈法) | 第23页 |
| 2.3.3 蛋白酶活力的测定 | 第23-24页 |
| 2.3.4 细菌基因组DNA的提取 | 第24页 |
| 2.3.5 菌株生长曲线 | 第24页 |
| 2.4 菌株的生理生化与分子鉴定 | 第24-25页 |
| 2.4.1 形态学观察与生理生化特性 | 第24-25页 |
| 2.4.2 菌株的分子鉴定 | 第25页 |
| 2.5 结果与分析 | 第25-28页 |
| 2.5.1 土壤样品中微生物的分离纯化 | 第25页 |
| 2.5.2 酪氨酸标准曲线的绘制 | 第25页 |
| 2.5.3 产蛋白酶菌株的筛选 | 第25-26页 |
| 2.5.4 菌株的形态学观察与生理生化试验 | 第26-27页 |
| 2.5.5 菌株的分子鉴定 | 第27页 |
| 2.5.6 菌株C9的生长曲线 | 第27-28页 |
| 2.6 结论 | 第28-29页 |
| 第三章 产高温蛋白酶菌株酶学特性与产酶条件的研究 | 第29-40页 |
| 3.1 试验材料 | 第29页 |
| 3.2 试验方法 | 第29-30页 |
| 3.2.1 制备粗酶液 | 第29页 |
| 3.2.2 蛋白酶活力的测定 | 第29页 |
| 3.2.3 蛋白酶酶学特性的研究 | 第29页 |
| 3.2.4 C9菌株发酵产酶条件的优化 | 第29-30页 |
| 3.3 结果与分析 | 第30-39页 |
| 3.3.1 蛋白酶酶学性质的研究 | 第30-33页 |
| 3.3.2 菌株C9发酵产酶条件的研究 | 第33-35页 |
| 3.3.3 运用响应面法发酵产酶条件的优化 | 第35-39页 |
| 3.4 结论 | 第39-40页 |
| 第四章 蛋白酶基因的克隆、表达分析及酶动力学研究 | 第40-48页 |
| 4.1 菌种和载体 | 第40页 |
| 4.2 试验方法 | 第40-42页 |
| 4.2.1 Bacillus tequilensisC9总DNA的提取 | 第40页 |
| 4.2.2 目的基因的克隆及序列分析 | 第40页 |
| 4.2.3 表达载体的构建及在大肠杆菌BL21中的表达 | 第40-41页 |
| 4.2.4 蛋白酶的分离纯化与酶动力学分析 | 第41-42页 |
| 4.3 结果与分析 | 第42-47页 |
| 4.3.1 蛋白酶基因apr的克隆 | 第42页 |
| 4.3.2 重组质粒的鉴定 | 第42-43页 |
| 4.3.3 重组质粒pMD18-apr测序及序列分析 | 第43-44页 |
| 4.3.4 表达载体的构建及在大肠杆菌BL21中的表达 | 第44-45页 |
| 4.3.5 目的基因诱导表达分析 | 第45页 |
| 4.3.6 透明圈活性检测 | 第45-46页 |
| 4.3.7 蛋白酶分离纯化 | 第46页 |
| 4.3.8 蛋白酶动力学参数的测定 | 第46-47页 |
| 4.4 结论 | 第47-48页 |
| 第五章 复合诱变育种选育高酶活诱变菌株 | 第48-53页 |
| 5.1 试验材料 | 第48页 |
| 5.2 试验方法 | 第48-49页 |
| 5.2.1 菌株筛选方法 | 第48页 |
| 5.2.2 蛋白酶活力的测定 | 第48页 |
| 5.2.3 复合诱变育种 | 第48页 |
| 5.2.4 遗传稳定性试验 | 第48-49页 |
| 5.3 结果与分析 | 第49-52页 |
| 5.3.1 紫外诱变结果 | 第49-50页 |
| 5.3.2 紫外-NTG复合诱变 | 第50页 |
| 5.3.3 突变菌株的筛选 | 第50-51页 |
| 5.3.4 遗传稳定性检测 | 第51-52页 |
| 5.4 结论 | 第52-53页 |
| 第六章 结论与展望 | 第53-56页 |
| 6.1 结论与讨论 | 第53-54页 |
| 6.2 展望 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
| 附录一 主要培养基、溶液配制 | 第63-65页 |
| 附录二 主要分子实验方法 | 第65-67页 |
| 作者简介及在学成果 | 第67页 |
