| 摘要 | 第2-4页 |
| Abstract | 第4-6页 |
| 符号表(缩略语表) | 第11-12页 |
| 主要仪器 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-30页 |
| 1 基因靶向编辑技术 | 第13-18页 |
| 1.1 ZFN技术 | 第14页 |
| 1.2 TALEN技术 | 第14-15页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9技术 | 第15-17页 |
| 1.4 NgAgo-gDNA编辑技术 | 第17-18页 |
| 2 MSTN基因 | 第18-21页 |
| 2.1 MSTN基因的研究进展 | 第18页 |
| 2.2 MSTN基因与生长性状的相关性研究 | 第18-19页 |
| 2.3 MSTN基因信号传导机制 | 第19-21页 |
| 3 转基因动物生产技术 | 第21-23页 |
| 3.1 显微注射法 | 第21-22页 |
| 3.2 逆转录病毒感染法 | 第22页 |
| 3.3 胚胎干细胞介导法 | 第22页 |
| 3.4 精子导入法 | 第22-23页 |
| 3.5 体细胞核移植技术 | 第23页 |
| 4 研究目的与意义 | 第23-25页 |
| 参考文献 | 第25-30页 |
| 第二章 MSTN基因敲除载体构建及活性验证 | 第30-41页 |
| 1 材料和试剂 | 第30-31页 |
| 1.1 实验材料 | 第30页 |
| 1.2 实验试剂 | 第30-31页 |
| 1.3 引物信息 | 第31页 |
| 2 方法和步骤 | 第31-34页 |
| 2.1 绵羊耳成纤维细胞(Sheep Ear Fibroblasts,SEFs)体外培养 | 第31-32页 |
| 2.1.1 组织贴壁法分离培养原代SEFs | 第31-32页 |
| 2.1.2 SEFs的传代培养 | 第32页 |
| 2.1.3 SEFs冻存及复苏 | 第32页 |
| 2.2 CRISPR/Cas9-MSTN-gRNA敲除质粒构建 | 第32-33页 |
| 2.2.1 MSTN基因体外克隆及SNP突变位点检 | 第32-33页 |
| 2.2.2 gRNA设计和载体构建 | 第33页 |
| 2.3 敲除载体活性验证 | 第33-34页 |
| 2.3.1 体外酶切活性检测SST gRNA靶点效率 | 第33-34页 |
| 2.3.2 脂质体法转染SEFs内源性检测载体敲除效率 | 第34页 |
| 3 实验结果 | 第34-37页 |
| 3.1 SEFs的分离培养 | 第34-35页 |
| 3.2 CRISPR/Cas9-MSTN-gRNA敲除质粒构建 | 第35页 |
| 3.3 敲除载体活性验证 | 第35-37页 |
| 4 讨论 | 第37-38页 |
| 5 结论 | 第38-39页 |
| 参考文献 | 第39-41页 |
| 第三章 MSTN基因敲除影响骨骼肌卫星细胞成肌分化的研究 | 第41-54页 |
| 1 实验材料 | 第41-43页 |
| 1.1 实验动物 | 第41-42页 |
| 1.2 实验试剂 | 第42页 |
| 1.3 引物信息 | 第42-43页 |
| 2 方法与步骤 | 第43-45页 |
| 2.1 sSMSCs体外分离培养鉴定与诱导 | 第43-44页 |
| 2.1.1 纤维消化法分离sSMSCs原代细胞 | 第43页 |
| 2.1.2 sSMSCs的传代培养与冻存复苏 | 第43页 |
| 2.1.3 间接免疫荧光法鉴定sSMSCs纯度 | 第43-44页 |
| 2.1.4 sSMSCs成肌诱导 | 第44页 |
| 2.2 puro对sSMSCs最小致死量的测定 | 第44页 |
| 2.3 MSTN基因的敲除表达及其对成肌分化的作用 | 第44-45页 |
| 3 实验结果 | 第45-49页 |
| 3.1 sSMSCs体外分离培养与鉴定 | 第45-46页 |
| 3.2 饥饿诱导sSMSCs分化形成肌管细胞 | 第46-47页 |
| 3.3 puro对sSMSCs的最小致死量 | 第47页 |
| 3.4 MSTN基因敲除对sSMSCs成肌分化的影响 | 第47-49页 |
| 4 讨论 | 第49-51页 |
| 5 结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-54页 |
| 第四章 无标记敲除MSTN基因绵羊成纤维细胞系建立 | 第54-64页 |
| 1 材料与试剂 | 第54-55页 |
| 1.1 实验材料 | 第54页 |
| 1.2 实验试剂 | 第54-55页 |
| 1.3 实验耗材 | 第55页 |
| 1.4 PCR引物和反应程序 | 第55页 |
| 2 方法与步骤 | 第55-57页 |
| 2.1 MSTN基因无标记敲除载体构建 | 第55-56页 |
| 2.2 MSTN敲除载体DNA电转染SEFs最佳条件确定 | 第56页 |
| 2.3 单克隆细胞系制备 | 第56-57页 |
| 2.4 MSTN基因敲除阳性细胞系的鉴定 | 第57页 |
| 3 结果 | 第57-61页 |
| 3.1 无标记MSTN敲除载体的获得 | 第57-58页 |
| 3.2 敲除载体电击法转染SEFs最佳条件检测 | 第58页 |
| 3.3 单克隆细胞系的制备 | 第58-59页 |
| 3.4 MSTN基因敲除阳性单细胞系的鉴定 | 第59-61页 |
| 4 讨论 | 第61-62页 |
| 5 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-64页 |
| 第五章 体细胞核移植制备转基因羊 | 第64-76页 |
| 1 材料与试剂 | 第64-66页 |
| 1.1 实验材料 | 第64页 |
| 1.3 实验试剂 | 第64-66页 |
| 2 方法与步骤 | 第66-68页 |
| 2.1 供体细胞准备 | 第66页 |
| 2.2 受体细胞准备 | 第66页 |
| 2.3 体细胞核移植 | 第66-67页 |
| 2.4 重组胚胎孤雌激活和体外发育 | 第67页 |
| 2.5 胚胎移植 | 第67-68页 |
| 3 实验结果 | 第68-73页 |
| 3.1 绵羊卵母细胞体外成熟 | 第68-69页 |
| 3.2 体细胞核移植以及重构胚胎发育 | 第69-71页 |
| 3.3 胚胎移植及妊娠检测 | 第71-73页 |
| 4 讨论 | 第73-74页 |
| 5 结论 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-76页 |
| 附录 | 第76-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
