| 中文摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 部分缩写及符号说明 | 第7-13页 |
| 一 引言 | 第13-19页 |
| 1 1型鸭甲肝病毒简介 | 第13页 |
| 2 DHAV的病原学特性 | 第13页 |
| 3 DHAV的增殖培养 | 第13-15页 |
| ·在鸭体内的增殖 | 第13-14页 |
| ·在胚体中的增殖 | 第14页 |
| ·在细胞中增殖 | 第14-15页 |
| 4 小RNA病毒VP0基因及编码蛋白的研究进展 | 第15-18页 |
| ·小RNA病毒基因组和DHAV基因组的结构特点 | 第15页 |
| ·小RNA病毒VP0基因编码蛋白的特点 | 第15-16页 |
| ·小RNA病毒VP2蛋白和VP4蛋白的结构特点 | 第16-17页 |
| ·小RNA病毒VP0蛋白的功能 | 第17-18页 |
| ·VP2蛋白的功能 | 第17-18页 |
| ·VP4蛋白的功能 | 第18页 |
| 5 选题的目的及意义 | 第18-19页 |
| 二 试验研究 | 第19-30页 |
| 1 材料 | 第19-21页 |
| ·毒株、菌种、血清和试验动物 | 第19页 |
| ·主要试剂 | 第19页 |
| ·其他实验材料 | 第19-20页 |
| ·常用试剂的配制 | 第20-21页 |
| 2 主要仪器设备 | 第21页 |
| 3 试验方法 | 第21-30页 |
| ·DHAV-1在鸭胚成纤维细胞中增殖特性研究 | 第21-23页 |
| ·制备鸭胚成纤维细胞(DEF) | 第21-22页 |
| ·DHAV-1在DEF上的适应 | 第22页 |
| ·DHAV-1在DEF中适应的鉴定 | 第22页 |
| ·DHAV-1在DEF中的增殖规律 | 第22-23页 |
| ·VP0基因及其截短基因的克隆、表达及纯化 | 第23-26页 |
| ·引物设计 | 第23页 |
| ·病毒RNA的提取 | 第23页 |
| ·VP0基因的RT-PCR扩增 | 第23-24页 |
| ·VP0基因及部分基因的T克隆 | 第24-25页 |
| ·原核表达载体pET-32a(+)/VP0-F和pGEX-4T-1/VP0-P的构建 | 第25页 |
| ·目的蛋白的表达及纯化 | 第25-26页 |
| ·表达蛋白的活性分析 | 第26-28页 |
| ·兔抗重组蛋白高免血清的制备 | 第26-27页 |
| ·重组蛋白抗血清中和效价的检测 | 第27-28页 |
| ·间接免疫荧光技术检测表达蛋白抗血清是否识别DHAV-1 | 第28页 |
| ·基于重组蛋白的ELISA方法的建立 | 第28-29页 |
| ·基于重组蛋白的ELISA方法反应条件的优化 | 第28页 |
| ·阳性阈值的确定 | 第28页 |
| ·ELISA方法的特异性检测 | 第28-29页 |
| ·变异系数 | 第29页 |
| ·基于重组蛋白的ELISA方法与DHAV-1包被的ELISA方法符合率的比较 | 第29页 |
| ·表达蛋白对雏鸭的免疫原性的初步研究 | 第29-30页 |
| ·实验动物分组及免疫 | 第29页 |
| ·试验鸭血样采集 | 第29页 |
| ·免疫细胞因子的检测 | 第29页 |
| ·雏鸭抗体效价检测 | 第29-30页 |
| 三 试验结果 | 第30-50页 |
| 1 DHAV-1在鸭胚成纤维细胞中增殖特性 | 第30-33页 |
| ·DHAV-1在鸭胚成纤维细胞中适应情况 | 第30页 |
| ·DHAV-1适应DEF的鉴定 | 第30-31页 |
| ·RT-PCR检测 | 第30页 |
| ·间接免疫荧光技术检测 | 第30页 |
| ·回归鸭胚试验 | 第30-31页 |
| ·DHAV-1在DEF中的增殖规律 | 第31-33页 |
| 2 VP0全基因(VP0-F)及部分基因(VP0-P)的克隆、表达及重组蛋白的纯化 | 第33-35页 |
| ·VP0-F和VP0-P基因的PCR扩增 | 第33页 |
| ·VP0-F和VP0-P基因的T克隆 | 第33-34页 |
| ·VP0-F和VP0-P基因的亚克隆 | 第34-35页 |
| 3 重组蛋白的大量表达及纯化 | 第35-38页 |
| ·重组蛋白的表达条件的优化结果 | 第35-37页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第37-38页 |
| ·VP0-F的Ni~(2+)-NTA亲和层析纯化 | 第37页 |
| ·VP0-P的切胶纯化 | 第37-38页 |
| ·重组蛋白的western-blot鉴定 | 第38页 |
| 4 兔抗VP0-P血清的活性分析 | 第38-40页 |
| ·兔抗VP0-P血清的效价的检测及抗体纯化 | 第38页 |
| ·鸡胚中和试验检测血清效价 | 第38页 |
| ·DHAV-1鸡胚适应毒株CELD_(50)的测定 | 第38页 |
| ·中和效价的测定 | 第38页 |
| ·间接免疫荧光技术检测VP0-P抗血清是否识别DHAV-1 | 第38-40页 |
| 5 基于VP0-F蛋白和VP0-P蛋白ELISA方法的建立 | 第40-48页 |
| ·抗原的最佳包被浓度和血清的最佳稀释度 | 第40页 |
| ·酶标抗体的最佳稀释度 | 第40-42页 |
| ·重组蛋白的包被条件 | 第42-43页 |
| ·最佳封闭液的选择 | 第43-44页 |
| ·最佳封闭时间 | 第44页 |
| ·显色时间的选择 | 第44-45页 |
| ·阳性阂值的确定 | 第45页 |
| ·特异性实验 | 第45-47页 |
| ·特异性交叉实验 | 第45-46页 |
| ·特异性阻断实验 | 第46-47页 |
| ·变异系数 | 第47-48页 |
| ·基于VP0-F的间接ELISA和基于VP0-P蛋白的间接ELISA方法与基于DHAV-1的间接ELISA方法符合率的检测 | 第48页 |
| 6 VP0-F和VP0-P蛋白对雏鸭的免疫效果检测 | 第48-50页 |
| ·VP0-F和VP0-P蛋白抗体水平的检测 | 第48页 |
| ·T淋巴细胞和细胞因子的水平检测 | 第48-50页 |
| 四 讨论 | 第50-54页 |
| 1 DHAV-1X株在DEF中的增殖 | 第50页 |
| 2 VP0重组蛋白的表达、纯化和活性分析 | 第50-51页 |
| 3 基于VP0重组蛋白的间接ELISA方法的建立及应用 | 第51-52页 |
| 4 重组蛋白诱导雏鸭产生ELISA抗体及其意义 | 第52-53页 |
| 5 重组蛋白诱导雏鸭产生细胞因子变化及其意义 | 第53-54页 |
| 五 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 攻读硕士学位期间论文发表 | 第62页 |
