| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-23页 |
| ·L-精氨酸及其生产 | 第11-17页 |
| ·L-精氨酸的性质 | 第11页 |
| ·L-精氨酸的用途及市场 | 第11-12页 |
| ·L-精氨酸的生产方法 | 第12页 |
| ·L-精氨酸生产菌株的国内外研究现状 | 第12-14页 |
| ·L-精氨酸合成代谢途径及其代谢调控 | 第14-17页 |
| ·代谢工程育种 | 第17-21页 |
| ·代谢工程 | 第17-18页 |
| ·代谢工程及相关技术在氨基酸育种中的应用 | 第18-20页 |
| ·L-精氨酸代谢工程育种研究进展 | 第20-21页 |
| ·立题背景与研究目的及意义 | 第21页 |
| ·本课题研究思路及研究内容 | 第21-23页 |
| 第二章 钝齿棒杆菌L-精氨酸合成相关基因簇的克隆及功能研究 | 第23-41页 |
| ·引言 | 第23-24页 |
| ·材料与方法 | 第24-29页 |
| ·菌株、质粒及相关引物 | 第24页 |
| ·主要试剂、相关培养基及培养条件 | 第24-25页 |
| ·钝齿棒杆菌染色体的提取 | 第25-26页 |
| ·相关PCR 反应及其产物回收 | 第26页 |
| ·重组质粒的构建与验证 | 第26页 |
| ·感受态细胞制备与转化 | 第26-27页 |
| ·阳性转化子的鉴定及质粒稳定性检测 | 第27页 |
| ·重组菌的蛋白表达分析 | 第27页 |
| ·目标蛋白纯化和蛋白含量测定 | 第27页 |
| ·酶活检测分析 | 第27-28页 |
| ·酶学性质的初步研究 | 第28-29页 |
| ·菌体生长量测定 | 第29页 |
| ·钝齿棒杆菌L-精氨酸发酵条件 | 第29页 |
| ·葡萄糖含量及氨基酸浓度测定 | 第29页 |
| ·结果与讨论 | 第29-40页 |
| ·钝齿棒杆菌SYPA 5-5 argCH 基因簇的克隆及其序列分析 | 第29-30页 |
| ·钝齿棒杆菌阻遏蛋白编码基因argR 突变分析 | 第30-31页 |
| ·钝齿棒杆菌SYPA 5-5 argC~argH 基因的克隆及其酶学性质研究 | 第31-34页 |
| ·基因argC~argH 分别在钝齿棒杆菌中的加强表达 | 第34-36页 |
| ·基因簇argCH 在钝齿棒杆菌中的克隆表达及其产酸研究 | 第36-40页 |
| ·本章小结 | 第40-41页 |
| 第三章 钝齿棒杆菌L-精氨酸合成途径中阻遏蛋白ArgR 功能分析 | 第41-67页 |
| ·引言 | 第41页 |
| ·材料与方法 | 第41-47页 |
| ·菌株、质粒及相关引物 | 第41页 |
| ·主要试剂、相关培养基及培养条件 | 第41-43页 |
| ·相关酶活力测定 | 第43页 |
| ·钝齿棒杆菌RNA 的提取与纯化 | 第43页 |
| ·RT-PCR | 第43页 |
| ·双向电泳(2-DE) | 第43-47页 |
| ·结果与讨论 | 第47-66页 |
| ·钝齿棒杆菌阻遏蛋白编码基因argR 的克隆及其序列分析 | 第47-48页 |
| ·钝齿棒杆菌CcargR 基因在大肠杆菌中的表达 | 第48页 |
| ·C. crenatum SYA 5 来源的argR (CcR) 在钝齿棒杆菌中过量表达 | 第48-49页 |
| ·ArgR 对钝齿棒杆菌精氨酸合成途径酶活的影响 | 第49-50页 |
| ·阻遏蛋白ArgR 对钝齿棒杆菌argC~argH 基因转录水平的影响 | 第50-51页 |
| ·阻遏蛋白ArgR 对精氨酸积累的影响 | 第51-52页 |
| ·采用2-DE 进行ArgR 差异蛋白质组学分析 | 第52-66页 |
| ·本章小结 | 第66-67页 |
| 第四章 钝齿棒杆菌精氨酸合成关键酶NAGK 抗反馈抑制定点改造 | 第67-91页 |
| ·引言 | 第67页 |
| ·材料与方法 | 第67-71页 |
| ·菌株、质粒和引物 | 第67-69页 |
| ·主要试剂、相关培养基及培养条件 | 第69页 |
| ·NAGK 的酶活测定及蛋白纯化 | 第69页 |
| ·精氨酸抑制实验 | 第69-70页 |
| ·酶反应动力学参数测定 | 第70页 |
| ·NAGK 二级结构预测 | 第70页 |
| ·同源建模及NAGK 蛋白结构同源比对 | 第70页 |
| ·蛋白结构三维空间模型的构建 | 第70页 |
| ·定点突变 | 第70-71页 |
| ·Western Blot 杂交验证 | 第71页 |
| ·结果与讨论 | 第71-90页 |
| ·大肠杆菌Ecol_NAGK 编码基因EcargB 的克隆表达 | 第71-72页 |
| ·Ccre_NAGK、Ecol_NAGK 的反馈抑制考察 | 第72-73页 |
| ·钝齿棒杆菌Ccre_NAGK 的二级结构分析 | 第73页 |
| ·不同来源的NAGK 序列同源比对 | 第73-75页 |
| ·钝齿棒杆菌Ccre_NAGK 的三级结构同源建模 | 第75-77页 |
| ·基于NAGK 三维结构的反馈抑制机理分析 | 第77-78页 |
| ·Ccre_NAGK 解除反馈抑制理性设计 | 第78-80页 |
| ·突变型argB’基因的克隆 | 第80-81页 |
| ·突变型Ccre_argB’在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达 | 第81-83页 |
| ·突变型Ccre_NAGK 的反馈抑制机理分析 | 第83-84页 |
| ·多点突变argB_(21) 及argB_(36) 的克隆 | 第84-85页 |
| ·突变型NAGK_(21) 和NAGK_(36) 的反馈抑制 | 第85-86页 |
| ·构建重组钝齿棒杆菌 SYPA 5-5-EcB 、SYPA 5-5-CCB_(36) 及 SYPA 5-5-CCB_(36H) | 第86-87页 |
| ·NAGK_(36) 及NAGK_(36H) 在钝齿棒杆菌中的表达、纯化及验证 | 第87-88页 |
| ·钝齿棒杆菌SYPA 5-5 与SYPA 5-5-CCB_(36) 发酵L-精氨酸分析比较 | 第88-90页 |
| ·本章小结 | 第90-91页 |
| 第五章 钝齿棒杆菌L-精氨酸合成竞争支路敲除及其发酵分析 | 第91-105页 |
| ·引言 | 第91-92页 |
| ·材料与方法 | 第92-95页 |
| ·菌株与质粒 | 第92-93页 |
| ·主要试剂、相关培养基及培养条件 | 第93页 |
| ·钝齿棒杆菌SYPA 5-5 染色体的提取 | 第93页 |
| ·缺失型片段的克隆 | 第93页 |
| ·重组自杀型质粒的构建 | 第93页 |
| ·自杀型质粒的转化原理与二次同源重组示意图 | 第93-94页 |
| ·缺失基因转化子的筛选 | 第94页 |
| ·转化子的菌落PCR 验证 | 第94页 |
| ·酶活测定实验 | 第94-95页 |
| ·重组钝齿棒杆菌产酸发酵 | 第95页 |
| ·结果与讨论 | 第95-104页 |
| ·精氨酸合成相关旁路基因proB、glnA、lysC 基因的克隆 | 第95页 |
| ·含同源整合片段的proB’等缺失型基因的克隆 | 第95页 |
| ·重组质粒pK18mobsacB-proB’等的构建及其验证 | 第95页 |
| ·重组钝齿棒杆菌△proB、△glnA、△lysC 缺失型菌株的筛选及验证 | 第95-96页 |
| ·重组C. crenatum SYPA 5-5 △proB 转化子的鉴定及酶活检测 | 第96-97页 |
| ·重组C. crenatum SYPA 5-5 △proB 转化子摇瓶发酵实验 | 第97-98页 |
| ·重组C. crenatum SYPA 5-5 △glnA 转化子的鉴定及酶活检测 | 第98-99页 |
| ·重组C. crenatum SYPA 5-5 △glnA 转化子摇瓶发酵实验 | 第99-100页 |
| ·重组C. crenatum SYPA 5-5 △lysC 转化子的鉴定及酶活检测 | 第100-101页 |
| ·重组C. crenatum SYPA 5-5 △lysC 转化子摇瓶发酵实验 | 第101-104页 |
| ·本章小结 | 第104-105页 |
| 第六章 高产L-精氨酸重组钝齿棒杆菌的构建及其代谢网络分析 | 第105-118页 |
| ·引言 | 第105-106页 |
| ·材料与方法 | 第106-108页 |
| ·菌株与质粒 | 第106页 |
| ·主要试剂、相关培养基及培养条件 | 第106页 |
| ·发酵液中氨基酸含量分析 | 第106-107页 |
| ·发酵液中有机酸含量测定 | 第107页 |
| ·代谢网络模型的计算方法 | 第107页 |
| ·钝齿棒杆菌SYPA 5-5 代谢网络的建立和简化 | 第107-108页 |
| ·结果与讨论 | 第108-117页 |
| ·钝齿棒杆菌SYPA 5-5 argCH 基因簇的定点突变 | 第108页 |
| ·重组质粒pJC1-9039_(SDB) 的构建 | 第108页 |
| ·重组菌C. crenatum SYPA 5-5△proB-9039_(SDB) 的构建 | 第108-109页 |
| ·重组菌C. crenatum SYPA 5-5△proB-9039_(SDB) 的遗传稳定性分析 | 第109页 |
| ·重组菌C. crenatum SYPA 5-5△proB-9039_(SDB) 相关酶活力测定 | 第109-110页 |
| ·重组菌C. crenatum△proB-9039_(SDB)摇瓶发酵产酸稳定性研究 | 第110页 |
| ·重组菌C. crenatum△proB-9039_(SDB) 5 L 发酵罐发酵产酸研究 | 第110-111页 |
| ·钝齿棒杆菌产酸发酵液中氨基酸和有机酸含量测定 | 第111-112页 |
| ·钝齿棒杆菌合成L-精氨酸代谢网络模型的简化 | 第112-113页 |
| ·重组菌C. crenatum △proB-9039_(SDB) 与SYPA 5-5 代谢流量分布 | 第113-115页 |
| ·重组菌C. crenatum SYPA 5-5 △proB-9039_(SDB) 的L-精氨酸合成代谢优势分析 | 第115-117页 |
| ·本章小结 | 第117-118页 |
| 主要结论与展望 | 第118-120页 |
| 主要结论 | 第118-119页 |
| 展望 | 第119-120页 |
| 论文创新点 | 第120-121页 |
| 致谢 | 第121-123页 |
| 参考文献 | 第123-132页 |
| 附录Ⅰ | 第132-138页 |
| 核苷酸及氨基酸序列 | 第132-136页 |
| Corynebacterium crenatum SYPA 5-5 胞内代谢反应方程 | 第136-137页 |
| 英文缩略语中文对照表 | 第137-138页 |
| 附录Ⅱ 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第138页 |
