| 致谢 | 第1-6页 |
| 摘要 | 第6-9页 |
| Abstract | 第9-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-39页 |
| ·手性化学品与生物拆分 | 第18-20页 |
| ·手性与手性化学品 | 第18-19页 |
| ·生物拆分的原理及其特点 | 第19-20页 |
| ·生物催化及其发展历程 | 第20-21页 |
| ·第一次技术浪潮 | 第20页 |
| ·第二次技术浪潮 | 第20-21页 |
| ·第三次技术浪潮 | 第21页 |
| ·生物催化剂 | 第21-22页 |
| ·生物催化剂的获得 | 第21-22页 |
| ·微生物来源生物催化剂的获得方法 | 第22页 |
| ·脂肪酶及其研究背景 | 第22-25页 |
| ·脂肪酶简介及其分类 | 第22-23页 |
| ·脂肪酶的结构特点 | 第23-24页 |
| ·脂肪酶的催化机理 | 第24-25页 |
| ·脂肪酶的手性选择性及其研究进展 | 第25-31页 |
| ·脂肪酶的选择性 | 第25-26页 |
| ·脂肪酶的立体选择性的结构基础 | 第26-28页 |
| ·提高脂肪酶的立体选择性的方法 | 第28-31页 |
| ·反应条件的影响 | 第28-29页 |
| ·脂肪酶分子固定化提高立体选择性 | 第29页 |
| ·加入冻干助剂提高立体选择性 | 第29页 |
| ·脂肪酶分子结构改造提高选择性 | 第29-31页 |
| ·l-薄荷醇制备的方法以及进展 | 第31-36页 |
| ·薄荷醇简介 | 第31-33页 |
| ·l-薄荷醇化学制备 | 第33-34页 |
| ·由旋光性天然化合物合成 | 第33页 |
| ·由无旋光性的化合物或石油化学品进行合成 | 第33-34页 |
| ·l-薄荷醇的生物催化制备 | 第34-36页 |
| ·本课题的研究思路与主要内容 | 第36-39页 |
| ·研究思路 | 第36-37页 |
| ·研究内容 | 第37-39页 |
| 第二章 脂肪酶PaL基因克隆、表达与酶学性质表征 | 第39-54页 |
| ·前言 | 第39页 |
| ·材料和方法 | 第39-42页 |
| ·质粒与菌种 | 第39页 |
| ·实验仪器 | 第39-40页 |
| ·主要试剂 | 第40页 |
| ·试剂配置 | 第40-41页 |
| ·培养基 | 第41-42页 |
| ·实验方法 | 第42-46页 |
| ·脂肪酶基因的表达及重组脂肪酶PaL纯化 | 第42-44页 |
| ·脂肪酶PaL基因导出 | 第42-43页 |
| ·表达载体的构建 | 第43页 |
| ·IPTG诱导表达 | 第43页 |
| ·脂肪酶的纯化与精确分子量测定 | 第43-44页 |
| ·重组脂肪酶PaL结构表征 | 第44页 |
| ·脂肪酶PaL肽指纹图谱表征 | 第44页 |
| ·脂肪酶PaL圆二色谱(CD)表征 | 第44页 |
| ·重组脂肪酶PaL基本酶学性质研究 | 第44-46页 |
| ·PaL酶活测定方法 | 第44-45页 |
| ·酶的最适温度 | 第45页 |
| ·酶的温度稳定性 | 第45页 |
| ·酶的最适pH | 第45页 |
| ·酶的酸碱稳定性 | 第45页 |
| ·脂肪酶PaL反应动力学研究 | 第45-46页 |
| ·脂肪酶PaL拆分外消旋薄荷醇丙酸酯的对映体选择性及非对映体选择性 | 第46页 |
| ·结果与讨论 | 第46-53页 |
| ·前期基因文库构建结果[75] | 第46-47页 |
| ·脂肪酶基因的表达及重组脂肪酶PaL纯化 | 第47-48页 |
| ·脂肪酶PaL的诱导表达 | 第47页 |
| ·脂肪酶的纯化 | 第47-48页 |
| ·重组脂肪酶PaL结构表征 | 第48-50页 |
| ·脂肪酶PaL肽指纹图谱表征 | 第48-50页 |
| ·脂肪酶PaL圆二色谱(CD)表征 | 第50页 |
| ·重组脂肪酶PaL基本酶学性质研究 | 第50-53页 |
| ·脂肪酶PaL的最适温度和温度稳定性 | 第50-51页 |
| ·脂肪酶PaL的最适pH和pH稳定性 | 第51-52页 |
| ·脂肪酶PaL反应动力学研究 | 第52页 |
| ·脂肪酶PaL拆分外消旋薄荷醇丙酸酯的对映体选择性及非对映体选择性 | 第52-53页 |
| ·本章小结 | 第53-54页 |
| 第三章 脂肪酶PaL的分子模建与对映体识别机理研究 | 第54-67页 |
| ·前言 | 第54-55页 |
| ·实验方法 | 第55-60页 |
| ·脂肪酶PaL的分子模建 | 第55-56页 |
| ·脂肪酶PaL模建结果验证 | 第56-57页 |
| ·对接受体蛋白准备 | 第57页 |
| ·底物配体的准备 | 第57页 |
| ·配体构象分析 | 第57-58页 |
| ·配体与脂肪酶PaL共价分子对接得到酶-底物复合物构象 | 第58页 |
| ·建立小分子配体的电荷信息以及力场参数 | 第58页 |
| ·创建非标准氨基酸Ser133力场参数 | 第58页 |
| ·结构初始化 | 第58-59页 |
| ·MD运算 | 第59页 |
| ·定点突变调节脂肪酶PaL的对映体选择性 | 第59-60页 |
| ·结果与讨论 | 第60-66页 |
| ·脂肪酶PaL的分子模建 | 第60-61页 |
| ·模型评价 | 第61页 |
| ·定点突变验证模型准确性 | 第61页 |
| ·底物分子共价对接及分子动力学模拟 | 第61-66页 |
| ·酶-底物复合物模拟过程中的骨架振动 | 第61-62页 |
| ·酶-底物复合物必须氢键的形成分析 | 第62-64页 |
| ·酶-底物复合物区域柔性分析 | 第64页 |
| ·催化残基His271的二面角变化 | 第64-65页 |
| ·定点突变调节脂肪酶PaL的对映体选择性 | 第65-66页 |
| ·本章小结 | 第66-67页 |
| 第四章 脂肪酶PaL非对映体分子识别机理及理性设计 | 第67-82页 |
| ·前言 | 第67-68页 |
| ·材料和方法 | 第68-69页 |
| ·质粒与菌种 | 第68页 |
| ·实验仪器 | 第68页 |
| ·主要试剂 | 第68-69页 |
| ·试剂配置 | 第69页 |
| ·培养基 | 第69页 |
| ·实验方法 | 第69-72页 |
| ·可反应底物与脂肪酶PaL的分子对接 | 第69-70页 |
| ·蛋白的准备 | 第69页 |
| ·配体的准备 | 第69页 |
| ·配体构象分析 | 第69-70页 |
| ·配体与脂肪酶PaL共价分子对接 | 第70页 |
| ·突变方法 | 第70-71页 |
| ·脂肪酶PaL各突变体诱导、纯化 | 第71页 |
| ·脂肪酶PaL拆分外消旋薄荷醇丙酸酯的非对映体选择性 | 第71页 |
| ·底物转化率和脂肪酶PaL及其突变体非对映体选择性的测定 | 第71页 |
| ·野生型及突变型脂肪酶V180L/A272F反应动力学参数测定 | 第71-72页 |
| ·脂肪酶PaL及其突变体的分子动力学(MD)模拟 | 第72页 |
| ·结构初始化 | 第72页 |
| ·MD运算 | 第72页 |
| ·结果与讨论 | 第72-79页 |
| ·底物分子共价对接及突变位点设计 | 第72-75页 |
| ·突变脂肪酶非对映体选择性及底物分子构型识别特异性测定 | 第75-76页 |
| ·野生型及体外修饰脂肪酶反应动力学参数测定 | 第76-77页 |
| ·分子动力学模拟及蛋白质区域柔性对非对映体选择性的影响 | 第77-79页 |
| ·本章小结 | 第79-82页 |
| 第五章 定点突变结合体外化学修饰提高脂肪酶PaL非对映体选择性 | 第82-96页 |
| ·前言 | 第82-83页 |
| ·材料和方法 | 第83-84页 |
| ·质粒与菌种 | 第83页 |
| ·实验仪器 | 第83页 |
| ·主要试剂 | 第83-84页 |
| ·试剂配置 | 第84页 |
| ·DTNB修饰液配置 | 第84页 |
| ·其他试剂 | 第84页 |
| ·培养基 | 第84页 |
| ·实验方法 | 第84-87页 |
| ·定点突变构建突变体A272C | 第84页 |
| ·突变型脂肪酶A272C的诱导、纯化 | 第84页 |
| ·突变型脂肪酶A272C的体外化学修饰与纯化 | 第84-85页 |
| ·修饰蛋白的质谱表征 | 第85页 |
| ·修饰蛋白的圆二色谱表征 | 第85页 |
| ·野生型、突变型及体外修饰脂肪酶拆分外消旋薄荷醇丙酸酯的非对映体选择性 | 第85页 |
| ·野生型及体外修饰脂肪酶反应动力学参数测定 | 第85-86页 |
| ·野生型、突变型及体外修饰脂肪酶PaL的分子动力学模拟 | 第86-87页 |
| ·蛋白文件、配体文件准备及底物分子共价对接 | 第86页 |
| ·野生型、突变型及体外修饰脂肪酶与底物复合物结构初始化 | 第86页 |
| ·MD运算 | 第86-87页 |
| ·结果与讨论 | 第87-95页 |
| ·修饰蛋白的质谱表征 | 第87-88页 |
| ·修饰蛋白的圆二色谱表征 | 第88-89页 |
| ·野生型脂肪酶PaL及其突变体A272C以及DTNB修饰脂肪酶的非对映体选择性表征 | 第89-90页 |
| ·野生型及体外修饰脂肪酶反应动力学参数测定 | 第90-91页 |
| ·野生型、突变型及体外修饰脂肪酶PaL的分子动力学模拟 | 第91-95页 |
| ·空间位阻效应的影响 | 第91-93页 |
| ·结构柔性的影响 | 第93-95页 |
| ·本章小结 | 第95-96页 |
| 第六章 重组E.coli高密度发酵制备脂肪酶PaL | 第96-110页 |
| ·前言 | 第96页 |
| ·材料和方法 | 第96-99页 |
| ·质粒与菌种 | 第96-97页 |
| ·实验仪器 | 第97页 |
| ·培养基 | 第97页 |
| ·培养方法 | 第97-98页 |
| ·摇瓶种子培养 | 第97页 |
| ·分批发酵培养 | 第97页 |
| ·补料分批发酵培养 | 第97-98页 |
| ·分析方法 | 第98-99页 |
| ·菌体干重的测定 | 第98-99页 |
| ·酶活测定方法 | 第99页 |
| ·葡萄糖浓度测定 | 第99页 |
| ·乙酸浓度测定 | 第99页 |
| ·实验结果 | 第99-108页 |
| ·分批发酵 | 第99-101页 |
| ·细胞干重对葡萄糖得率系数测定 | 第99-100页 |
| ·诱导温度确定 | 第100-101页 |
| ·补料分批发酵 | 第101-108页 |
| ·控制不同比生长速率对发酵菌体密度的影响 | 第101-104页 |
| ·不同诱导时机对发酵产酶的影响 | 第104-107页 |
| ·不同诱导剂(IPTG)加量对发酵产酶的影响 | 第107-108页 |
| ·本章小结 | 第108-110页 |
| 第七章 重组E.coil全细胞水解拆分外消旋薄荷醇并酸酯制备Ⅰ-薄荷醇的研究 | 第110-126页 |
| ·前言 | 第110页 |
| ·材料和方法 | 第110-114页 |
| ·转化所用全细胞 | 第110页 |
| ·主要试剂 | 第110页 |
| ·实验仪器 | 第110-111页 |
| ·重组全细胞温度及温度稳定性测定 | 第111页 |
| ·重组全细胞在不同温度条件下的半衰期及产物的光学纯度 | 第111页 |
| ·全细胞用量实验 | 第111页 |
| ·最适底物浓度测定 | 第111-112页 |
| ·最适助溶剂用量测定 | 第112页 |
| ·重组全细胞的产物抑制与产物分配系数测定 | 第112页 |
| ·重组全细胞催化反应的批次反应稳定性 | 第112-113页 |
| ·产物l-薄荷醇与底物的分离 | 第113页 |
| ·产物l-薄荷醇鉴定 | 第113页 |
| ·产物l-薄荷醇精馏制备 | 第113-114页 |
| ·实验结果 | 第114-124页 |
| ·转化过程温度的选择 | 第114-115页 |
| ·转化过程温度的选择 | 第115-116页 |
| ·全细胞用量的确定 | 第116-117页 |
| ·底物浓度的确定 | 第117页 |
| ·最适助溶剂浓度的确定 | 第117-119页 |
| ·产物浓度对全细胞催化不对称水解反应的影响及产物分配系数测定 | 第119页 |
| ·重组全细胞反应的批次反应稳定性 | 第119-120页 |
| ·产物l-薄荷醇的分离提取及鉴定 | 第120-122页 |
| ·l-薄荷醇的分离提取与纯化 | 第120-121页 |
| ·所得l-薄荷醇的结构鉴定 | 第121-122页 |
| ·产物l-薄荷醇精馏制备及物料衡算 | 第122-124页 |
| ·总结 | 第124-126页 |
| 第八章 总结与展望 | 第126-130页 |
| ·总结 | 第126-128页 |
| ·展望 | 第128-130页 |
| 参考文献 | 第130-144页 |
| 附录 | 第144-157页 |
| 作者简介及博士期间的研究成果 | 第157页 |
