| 目录 | 第1-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-13页 |
| 符号和缩略语说明 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-34页 |
| 1 灵芝的分子生物学研究进展 | 第14-15页 |
| ·灵芝分类学的研究 | 第14页 |
| ·灵芝基因克隆方面的进展 | 第14-15页 |
| ·灵芝转化系统研究 | 第15页 |
| 2 丝状真菌转化系统研究 | 第15-18页 |
| ·PEG法 | 第16页 |
| ·电激法 | 第16-17页 |
| ·基因枪法 | 第17页 |
| ·限制酶介导的DNA整合法 | 第17页 |
| ·根癌农杆菌介导法(ATMT) | 第17-18页 |
| 3 根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化的研究 | 第18-20页 |
| ·根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化的分子基础 | 第18-19页 |
| ·影响ATMT转化效率的因素 | 第19-20页 |
| 4 ATMT在丝状真菌功能基因组学研究中的应用 | 第20-22页 |
| ·ATMT技术应用于正向和反向遗传学研究 | 第21页 |
| ·ATMT技术应用于随机插入突变库的构建 | 第21页 |
| ·ATMT技术应用于基因定向突变 | 第21-22页 |
| 5 灵芝药用成分功能及研究进展 | 第22-24页 |
| ·灵芝三萜的化学结构和药理作用研究 | 第22-24页 |
| 6 灵芝三萜的生物合成研究 | 第24-31页 |
| ·环境因素对灵芝三萜含量的影响 | 第24-26页 |
| ·灵芝三萜生物合成途径研究 | 第26-31页 |
| 7 本论文的研究意义及主要内容 | 第31-34页 |
| 第二章 根癌农杆菌介导的灵芝遗传转化体系的建立 | 第34-62页 |
| 第一节 根癌农杆菌介导的灵芝遗传转化体系初步建立 | 第34-46页 |
| 1 实验材料 | 第34页 |
| ·菌株、质粒、试剂 | 第34页 |
| ·菌株培养 | 第34页 |
| 2 实验方法 | 第34-43页 |
| ·灵芝基因组DNA的提取(CTAB法) | 第34-35页 |
| ·双元载体的构建 | 第35-38页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第38-39页 |
| ·农杆菌介导的灵芝转化 | 第39-40页 |
| ·灵芝转化子的验证 | 第40-43页 |
| 3 结果与讨论 | 第43-46页 |
| ·双元载体pGl-GPD的构建 | 第43页 |
| ·双元载体pGl-GPD转化农杆菌LBA4404 | 第43页 |
| ·农杆菌LBA4404介导的灵芝原生质体转化 | 第43-44页 |
| ·灵芝转化子的分子水平验证 | 第44-45页 |
| ·灵芝转化子有丝分裂稳定性验证 | 第45-46页 |
| 第二节 根癌农杆菌介导的灵芝转化体系的优化 | 第46-53页 |
| 1 实验材料 | 第46页 |
| ·菌株、质粒、试剂 | 第46页 |
| ·菌株培养 | 第46页 |
| 2 实验方法 | 第46-49页 |
| ·共培养参数的优化 | 第46页 |
| ·不同启动子对外源基因表达的影响 | 第46-49页 |
| ·统计学分析 | 第49页 |
| 3 结果与讨论 | 第49-53页 |
| ·共培养参数的优化 | 第49-52页 |
| ·不同启动子对外源基因表达的影响 | 第52-53页 |
| 第三节 灵芝报告基因的选择与检测 | 第53-62页 |
| 1 实验材料 | 第53页 |
| ·菌株、质粒、试剂 | 第53页 |
| ·菌株培养 | 第53页 |
| 2 实验方法 | 第53-57页 |
| ·报告基因表达载体的构建 | 第53-56页 |
| ·农杆菌介导的灵芝转化 | 第56页 |
| ·潮霉素抗性转化子的筛选及PCR验证 | 第56页 |
| ·报告基因的检测 | 第56-57页 |
| 3 结果与讨论 | 第57-62页 |
| ·egfg报告基因的检测 | 第57-59页 |
| ·gus报告基因的检测 | 第59-62页 |
| 第三章 应用根癌农杆菌介导的灵芝遗传转化体系进行灵芝三萜生物合成相关基因过表达研究 | 第62-80页 |
| 1 实验材料 | 第62-63页 |
| ·菌株和质粒 | 第62页 |
| ·菌株培养 | 第62页 |
| ·酶和生化试剂 | 第62-63页 |
| 2 实验方法 | 第63-72页 |
| ·灵芝cDNA的合成 | 第63-64页 |
| ·Gl-mvd过表达载体的构建 | 第64-66页 |
| ·农杆菌介导的灵芝转化 | 第66-67页 |
| ·转化子的筛选及PCR验证 | 第67页 |
| ·转化子中mvd基因mRNA水平表达量的影响 | 第67-68页 |
| ·转化子中mvd基因蛋白质水平表达量的影响 | 第68-70页 |
| ·转化子中灵芝三萜含量的测定 | 第70页 |
| ·转化子中灵芝三萜生物合成途径中其他关键酶的影响 | 第70-71页 |
| ·统计学分析 | 第71-72页 |
| 3 结果与讨论 | 第72-80页 |
| ·Gl-mvd基因过表达载体的构建 | 第72页 |
| ·Gl-mvd基因过表达转化子的筛选 | 第72-73页 |
| ·Gl-mvd在灵芝中的过表达分析 | 第73-80页 |
| 第四章 应用根癌农杆菌介导的灵芝遗传转化体系进行灵芝鲨烯合酶基因的启动子分析研究 | 第80-104页 |
| 第一节 灵芝鲨烯合酶启动子的获得和生物信息学分析 | 第80-85页 |
| 1 实验材料 | 第80-81页 |
| ·菌株和质粒 | 第80页 |
| ·菌株培养 | 第80-81页 |
| ·酶和生化试剂 | 第81页 |
| 2 实验方法 | 第81-82页 |
| ·灵芝总DNA的提取 | 第81页 |
| ·灵芝鲨烯合酶启动子的扩增和分析 | 第81-82页 |
| 3 结果与讨论 | 第82-85页 |
| 第二节 灵芝鲨烯合酶启动子基本活性分析 | 第85-95页 |
| 1 实验材料 | 第85页 |
| ·菌株和质粒 | 第85页 |
| ·菌株培养 | 第85页 |
| ·酶和生化试剂 | 第85页 |
| 2 实验方法 | 第85-90页 |
| ·灵芝总DNA的提取 | 第85页 |
| ·灵芝sqs基因启动子缺失表达载体的构建 | 第85-89页 |
| ·农杆菌介导的灵芝转化 | 第89页 |
| ·GUS酶活力的荧光测定 | 第89-90页 |
| 3 结果与讨论 | 第90-95页 |
| ·灵芝sqs基因启动子缺失表达载体的构建 | 第90-91页 |
| ·灵芝sqs基因启动子5’缺失分析 | 第91-93页 |
| ·灵芝sqs基因启动子-868至-673区域5'缺失分析 | 第93-95页 |
| 第三节 灵芝鲨烯合酶启动子响应MeJA诱导活性分析 | 第95-104页 |
| 1 实验材料 | 第95页 |
| ·菌株和质粒 | 第95页 |
| ·菌株培养 | 第95页 |
| ·酶和生化试剂 | 第95页 |
| 2 实验方法 | 第95-98页 |
| ·灵芝总DNA的提取 | 第95-96页 |
| ·灵芝sqs基因启动子MeJA响应元件突变表达载体的构建 | 第96-98页 |
| ·农杆菌介导的灵芝转化 | 第98页 |
| ·GUS酶活力的荧光测定 | 第98页 |
| 3 结果与讨论 | 第98-104页 |
| ·灵芝sqs基因启动子MeJA响应元件突变表达载体的构建 | 第98-99页 |
| ·灵芝sqs基因启动子5'缺失表达载体对MeJA响应的研究 | 第99-100页 |
| ·灵芝sqs基因启动子MeJA响应元件的突变分析 | 第100-104页 |
| 全文总结 | 第104-106页 |
| 创新点 | 第106-108页 |
| 已发表文章情况 | 第108-110页 |
| 参考文献 | 第110-124页 |
| 附录 | 第124-126页 |
| 致谢 | 第126页 |
