| 第一章 文献综述 | 第1-29页 |
| 1．1 克痛宁(蛇神经毒素)简介 | 第12-21页 |
| 1．1．1 蛇神经毒素的分类 | 第13-14页 |
| 1．1．2 蛇神经毒素的分子结构 | 第14-16页 |
| 1．1．3 蛇神经毒素的受体 | 第16-17页 |
| 1．1．4 蛇神经毒素作用的分子机制 | 第17-18页 |
| 1．1．5 蛇神经毒素在理论研究中的应用 | 第18页 |
| 1．1．6 蛇神经毒素的临床应用 | 第18-19页 |
| 1．1．7 研究现状及发展趋势 | 第19页 |
| 1．1．8 蛇毒α-神经毒素及其基因研究进展 | 第19-21页 |
| 1．1．8．1 α-NT蛋白质结构 | 第19-20页 |
| 1．1．8．2 α-NT的cDNA | 第20页 |
| 1．1．8．3 α-NT的基因组DNA | 第20-21页 |
| 1．1．8．4 α-NT的人工合成与表达 | 第21页 |
| 1．2 酵母表达系统 | 第21-28页 |
| 1．2．1 异源蛋白在酵母菌中表达的一般步骤 | 第21-22页 |
| 1．2．2 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 | 第22-28页 |
| 1．2．2．1 巴斯德毕赤酵母表达系统简介 | 第22-23页 |
| 1．2．2．2 表达载体的发展 | 第23-24页 |
| 1．2．2．3 受体菌的发展 | 第24-25页 |
| 1．2．2．4 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中高效表达的策略 | 第25-27页 |
| 1．2．2．5 总结和展望 | 第27-28页 |
| 1．3 论文的新颖性 | 第28-29页 |
| 第二章 克痛宁(CBT)重组菌株的构建及筛选 | 第29-36页 |
| 2．1 设计思路及研究方案 | 第29-30页 |
| 2．1．1 基因序列的设计 | 第29页 |
| 2．1．2 研究方案 | 第29-30页 |
| 2．2 实验材料与方法 | 第30-36页 |
| 2．2．1 实验材料 | 第30-31页 |
| 2．2．1．1 菌种和质粒 | 第30页 |
| 2．2．1．2 其它材料 | 第30页 |
| 2．2．1．3 仪器设备 | 第30-31页 |
| 2．2．2 试验方法 | 第31-33页 |
| 2．2．2．1 pPIC9K／Bi质粒的提取 | 第31-32页 |
| 2．2．2．2 pPIC9K／Bi质粒线性化 | 第32页 |
| 2．2．2．3 pPIC9K／Bi质粒浓度与纯度的测定 | 第32页 |
| 2．2．2．4 pPIC9K／Bi质粒的检验 | 第32页 |
| 2．2．2．5 制备GS115感受态 | 第32-33页 |
| 2．2．2．6 电转化 | 第33页 |
| 2．2．2．7 筛选his~+Mut~s阳性克隆 | 第33页 |
| 2．2．2．8 G418筛选高拷贝转化子 | 第33页 |
| 2．2．3 结果与讨论 | 第33-36页 |
| 2．2．3．1 提取pPIC9K／Bi质粒浓度与纯度测定 | 第33-34页 |
| 2．2．3．2 对pPIC9K／Bi质粒进行DNA测序 | 第34页 |
| 2．2．3．3 电转化及其条件的优化 | 第34页 |
| 2．2．3．4 His~+Mut~s转化子与高拷贝转化子的筛选 | 第34-36页 |
| 第三章 目标蛋白的诱导表达与分析 | 第36-40页 |
| 3．1 研究目的 | 第36页 |
| 3．2 试验材料 | 第36-37页 |
| 3．2．1 试剂 | 第36页 |
| 3．2．2 仪器设备 | 第36-37页 |
| 3．3 试验方法 | 第37-39页 |
| 3．3．1 克痛宁(CBT)在高拷贝数菌株中的诱导表达 | 第37页 |
| 3．3．2 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳 | 第37-39页 |
| 3．3．2．1 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳缓冲液体系 | 第37页 |
| 3．3．2．2 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳垂直板凝胶的制备 | 第37-38页 |
| 3．3．2．3 蛋白样品的制备 | 第38页 |
| 3．3．2．4 蛋白样品的凝胶电泳 | 第38页 |
| 3．3．2．5 电泳后凝胶的固定及染色 | 第38-39页 |
| 3．4 结果与讨论 | 第39页 |
| 3．5 本章小结 | 第39-40页 |
| 第四章 发酵培养条件的优化 | 第40-49页 |
| 4．1 研究目的 | 第40页 |
| 4．2 试验材料 | 第40-41页 |
| 4．2．1 菌种 | 第40页 |
| 4．2．2 试剂 | 第40页 |
| 4．2．3 仪器设备 | 第40-41页 |
| 4．3 试验操作及方法 | 第41-43页 |
| 4．3．1 基础盐培养基发酵 | 第41页 |
| 4．3．2 细胞干湿重与OD_(600)值关系的测定 | 第41页 |
| 4．3．3 发酵液中中甘油浓度的测定 | 第41-42页 |
| 4．3．3．1测定原理 | 第41-42页 |
| 4．3．3．2 测定方法 | 第42页 |
| 4．3．4 发酵液中总蛋白浓度的测定 | 第42-43页 |
| 4．3．4．1 原理 | 第42页 |
| 4．3．4．2 各种母液的配制 | 第42-43页 |
| 4．3．4．3 标准曲线的测定 | 第43页 |
| 4．3．4．4 发酵液样品蛋白浓度的测定 | 第43页 |
| 4．3．5 发酵条件的优化 | 第43页 |
| 4．3．6 克痛宁(CBT)的小试发酵 | 第43页 |
| 4．4 结果与讨论 | 第43-48页 |
| 4．4．1 细胞干湿重与OD_(600)值的关系 | 第43-44页 |
| 4．4．2 发酵条件的优化 | 第44-47页 |
| 4．4．2．1诱导期pH值的优化 | 第44-45页 |
| 4．4．2．2 溶氧条件的优化 | 第45-46页 |
| 4．4．2．3 补加油酸策略的优化 | 第46页 |
| 4．4．2．4培养基组分的优化 | 第46-47页 |
| 4．4．3 克痛宁的小试放大 | 第47-48页 |
| 4．5 本章小结 | 第48-49页 |
| 第五章 克痛宁的初步分离纯化及活性鉴定 | 第49-53页 |
| 5．1 研究目的 | 第49页 |
| 5．2 材料与仪器 | 第49页 |
| 5．3 实验方法 | 第49-51页 |
| 5．3．1 样品预处理 | 第49-50页 |
| 5．3．2 去除杂蛋白 | 第50页 |
| 5．3．3 离子交换吸附 | 第50-51页 |
| 5．5 活性鉴定 | 第51-52页 |
| 5．5．1 目标蛋白前体的酶切 | 第51-52页 |
| 5．5．2 动物实验验证 | 第52页 |
| 5．6 本章小结 | 第52-53页 |
| 第六章 结论 | 第53-54页 |
| 第七章 问题与建议 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-60页 |
| 附录一 培养基 | 第60-62页 |
| 附录二 缓冲液 | 第62-65页 |
| 附录三：离子交换柱特征表 | 第65-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第72页 |
