| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-43页 |
| ·嗜热环境与嗜热微生物 | 第14-15页 |
| ·云南腾冲热海高温热泉中微生物的研究 | 第15-16页 |
| ·免培养方法研究嗜热微生物 | 第16-18页 |
| ·免培养法的基本原理和技术策略 | 第16-17页 |
| ·免培养方法的应用 | 第17-18页 |
| ·研究高温地热环境中嗜热菌和嗜热酶的意义 | 第18页 |
| ·Geobacillus菌属 | 第18-20页 |
| ·角蛋白酶的研究进展 | 第20-29页 |
| ·角蛋白概述 | 第20-21页 |
| ·角蛋白降解的生化机制 | 第21-23页 |
| ·角蛋白的酶解机理 | 第23-24页 |
| ·产生角蛋白酶的微生物 | 第24-25页 |
| ·角蛋白酶的分子生物学研究进展 | 第25-28页 |
| ·角蛋白酶的应用前景 | 第28-29页 |
| ·脂肪酶研究进展 | 第29-38页 |
| ·脂肪酶活力测定方法 | 第30-32页 |
| ·脂肪酶的应用 | 第32-35页 |
| ·嗜极端条件脂肪酶的研究 | 第35-36页 |
| ·微生物脂肪酶的基因特点 | 第36页 |
| ·脂肪酶的结构与催化机理 | 第36-38页 |
| ·影响嗜热酶稳定性的因素 | 第38-41页 |
| ·蛋白分子间的相互作用力 | 第38-39页 |
| ·构象的刚性与柔性 | 第39-40页 |
| ·脯氨酸 | 第40页 |
| ·α螺旋的稳定性 | 第40-41页 |
| ·本文工作开展思路 | 第41-43页 |
| 第二章 云南腾冲热泉的嗜热微生物遗传多样性分析 | 第43-54页 |
| ·实验材料 | 第43-44页 |
| ·药品与试剂 | 第43页 |
| ·主要仪器 | 第43页 |
| ·培养基 | 第43页 |
| ·主要材料 | 第43-44页 |
| ·实验方法 | 第44-47页 |
| ·环境总DNA的提取 | 第44页 |
| ·环境DNA的16S rDNA基因序列PCR扩增 | 第44页 |
| ·PCR产物的电泳检测 | 第44-45页 |
| ·产物纯化回收 | 第45页 |
| ·连接反应产物与转化 | 第45页 |
| ·提取质粒筛选阳性克隆 | 第45-46页 |
| ·利用RFLP方法挑选含有目的片断的单克隆 | 第46-47页 |
| ·结果与讨论 | 第47-53页 |
| ·16S rDNA基因序列结果 | 第47-49页 |
| ·环境DNA中16S rDNA的进化树分析 | 第49-53页 |
| ·本章小结 | 第53-54页 |
| 第三章 降解羽毛角蛋白酶菌株筛选及酶学性质鉴定 | 第54-65页 |
| ·实验材料 | 第54页 |
| ·样品来源 | 第54页 |
| ·底物来源 | 第54页 |
| ·培养基 | 第54页 |
| ·实验方法 | 第54-58页 |
| ·降解角蛋白微生物的选育及初步鉴定 | 第54-55页 |
| ·菌株16S rDNA鉴定 | 第55-56页 |
| ·角蛋白酶的初步分离纯化 | 第56页 |
| ·活性染色 | 第56页 |
| ·酶学理化性质研究 | 第56-58页 |
| ·结果与讨论 | 第58-64页 |
| ·角蛋白酶高产菌株的筛选分离 | 第58页 |
| ·分离菌株的鉴定 | 第58-60页 |
| ·角蛋白酶分离纯化 | 第60-61页 |
| ·酶学性质的初步研究 | 第61-64页 |
| ·本章小结 | 第64-65页 |
| 第四章 嗜热芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆与表达以及蛋白的纯化和酶学性质研究 | 第65-79页 |
| ·实验材料 | 第65页 |
| ·药品与试剂 | 第65页 |
| ·主要仪器 | 第65页 |
| ·培养基 | 第65页 |
| ·菌株与质粒 | 第65页 |
| ·实验方法 | 第65-69页 |
| ·基因组DNA提取 | 第66页 |
| ·脂肪酶lipGRD基因的克隆 | 第66-67页 |
| ·蛋白的表达与纯化 | 第67页 |
| ·脂肪酶活性测定 | 第67-68页 |
| ·lipGRD基因在毕赤酵母中表达 | 第68-69页 |
| ·结果与讨论 | 第69-77页 |
| ·脂肪酶基因的克隆、表达及蛋白质纯化 | 第70-71页 |
| ·lipGRD同源序列比对 | 第71-72页 |
| ·蛋白的表达与纯化 | 第72页 |
| ·脂肪酶lipGRD的酶活测定 | 第72-77页 |
| ·本章小结 | 第77-79页 |
| 第五章 嗜热脂肪酶lipGRD氨基酸残基Y224突变对酶热稳定性的影响 | 第79-90页 |
| ·实验材料 | 第79页 |
| ·实验方法 | 第79-82页 |
| ·突变体的构建 | 第79-80页 |
| ·突变体蛋白表达和纯化 | 第80页 |
| ·突变体活性检测 | 第80-81页 |
| ·野生型与突变体酶反应动力学比较 | 第81页 |
| ·蛋白结构模式图构建 | 第81-82页 |
| ·结果与讨论 | 第82-89页 |
| ·Y224C突变引起酶热稳定性丧失 | 第82页 |
| ·224位酪氨酸点突变体的载体的构建和蛋白的表达 | 第82-84页 |
| ·点突变体的表达与纯化 | 第84-85页 |
| ·野生型和点突变体的最适温度和最适pH值比较 | 第85-86页 |
| ·Y224C和Y224P的热稳定性 | 第86-87页 |
| ·lipGRD的结构及初步分析 | 第87-89页 |
| ·本章小结 | 第89-90页 |
| 总结与展望 | 第90-92页 |
| 参考文献 | 第92-103页 |
| 附录一:主要药品和试剂 | 第103-104页 |
| 附录二:本文所使用的主要仪器 | 第104-105页 |
| 附录三:本文所涉及的培养基 | 第105-107页 |
| 附录四:主要溶液配方 | 第107-109页 |
| 附录五:环境总DNA的提取 | 第109-110页 |
| 附录六:CaCl_2法制备感受态细胞 | 第110-111页 |
| 附录七:PCR扩增及双酶切的体系 | 第111-112页 |
| 附录八:对硝基苯酚法检测脂肪酶活性 | 第112-113页 |
| 附录九:毕赤酵母感受态细胞制备及电击转化步骤 | 第113-114页 |
| 附录十:本文所用的质粒载体物理图谱 | 第114-117页 |
| 致谢 | 第117-118页 |
| 博士期间已发表和待发表的文章 | 第118-119页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第119-120页 |
| 外文论文 | 第120-158页 |