| 摘要 | 第5-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 第一章 背景介绍 | 第15-34页 |
| 1.1 脆性X染色体综合征 | 第15-16页 |
| 1.1.1 发现历史 | 第15页 |
| 1.1.2 FMR1基因 | 第15-16页 |
| 1.2 FMRP蛋白 | 第16-20页 |
| 1.2.1 FMRP蛋白结构 | 第16-18页 |
| 1.2.2 FMRP结合RNA的序列特征 | 第18页 |
| 1.2.3 FMRP结合蛋白 | 第18页 |
| 1.2.4 FMRP蛋白翻译后修饰 | 第18-19页 |
| 1.2.5 Fmr1缺失信号通路变化 | 第19-20页 |
| 1.3 脆性X染色体综合征的研究模型 | 第20-21页 |
| 1.3.1 FXS病人 | 第20页 |
| 1.3.2 小鼠模型 | 第20-21页 |
| 1.3.3 果蝇模型 | 第21页 |
| 1.3.4 斑马鱼模型 | 第21页 |
| 1.4 FXS的治疗 | 第21-22页 |
| 1.5 蛋白质组学 | 第22-31页 |
| 1.5.1 质谱介绍 | 第23-26页 |
| 1.5.2 蛋白组学定量技术 | 第26-31页 |
| 1.5.3 非标记定量Labelfreequantification | 第31页 |
| 1.6 磷酸化组学 | 第31-32页 |
| 1.6.1 多维色谱分离 | 第31-32页 |
| 1.7 磷酸化修饰富集 | 第32-34页 |
| 1.7.1 抗体富集 | 第32页 |
| 1.7.2 固相金属离子亲和色谱(IMAC) | 第32-33页 |
| 1.7.3 金属氧化物富集法 | 第33页 |
| 1.7.4 富集方法的组合使用 | 第33-34页 |
| 第二章 材料、仪器、试剂及主要方法 | 第34-54页 |
| 2.1 实验动物 | 第34页 |
| 2.2 实验细胞系 | 第34页 |
| 2.3 质粒 | 第34页 |
| 2.4 抗体 | 第34-35页 |
| 2.5 试剂 | 第35-39页 |
| 2.6 实验仪器 | 第39-41页 |
| 2.7 实验方法 | 第41-54页 |
| 2.7.1 细胞培养 | 第41页 |
| 2.7.2 基因组DNA提取 | 第41-42页 |
| 2.7.3 基因型鉴定(genotyping) | 第42页 |
| 2.7.4 点突变质粒构建 | 第42-43页 |
| 2.7.5 免疫印迹WesternBlot | 第43-45页 |
| 2.7.6 细胞转染实验 | 第45-46页 |
| 2.7.7 免疫荧光及激光共聚焦 | 第46页 |
| 2.7.8 ShFMR1敲低细胞系构建 | 第46-48页 |
| 2.7.9 小鼠胚胎成纤维细胞制备 | 第48-49页 |
| 2.7.10 基于超滤辅助的样品制备FASP | 第49-50页 |
| 2.7.11 TMT标记 | 第50页 |
| 2.7.12 高pH-反向色谱分离(HighpHRP) | 第50-51页 |
| 2.7.13 二氧化钛磷酸化富集 | 第51-52页 |
| 2.7.14 多肽固相脱盐处理 | 第52页 |
| 2.7.15 高压液相色谱串联质谱分析(LC/MS/MS) | 第52-53页 |
| 2.7.16 主要数据库、算法和软件 | 第53-54页 |
| 第三章 Fmr1基因敲除小鼠大脑皮层蛋白质组和磷酸化组变化 | 第54-80页 |
| 3.1 实验流程 | 第54-56页 |
| 3.2 Fmr1KO小鼠基因型鉴定 | 第56-57页 |
| 3.3 蛋白水平确认FMRP蛋白的敲除 | 第57页 |
| 3.4 Fmr1KO小鼠中整体磷酸化水平略有上升 | 第57-58页 |
| 3.5 High-pH反向色谱分离 | 第58-59页 |
| 3.6 质量误差分布 | 第59页 |
| 3.7 磷酸化富集分析 | 第59-61页 |
| 3.8 相关性分析 | 第61-62页 |
| 3.9 Fmr1KO小鼠大脑皮层蛋白质组变化 | 第62-64页 |
| 3.10 Fmr1KO小鼠大脑皮层磷酸化变化 | 第64-65页 |
| 3.11 Motif分析 | 第65-67页 |
| 3.12 基因聚类分析 | 第67-70页 |
| 3.13 磷酸化上调位点 | 第70-72页 |
| 3.14 蛋白水平、磷酸化组水平及RNA免疫沉淀联合分析 | 第72-73页 |
| 3.15 蛋白水平、磷酸化组水平、转录水平及RNA免疫沉淀联合分析 | 第73-74页 |
| 3.16 基态下PRKRA磷酸化不影响其定位 | 第74-75页 |
| 3.17 PRKRA与FMRP共定位 | 第75-76页 |
| 3.18 PRKRA磷酸化影响压力胁迫下的细胞凋亡 | 第76-80页 |
| 第四章 靶向质谱探索FMRP下游信号通路 | 第80-95页 |
| 4.1 背景 | 第80页 |
| 4.2 平行反应监测(PRM) | 第80-82页 |
| 4.3 方法 | 第82-85页 |
| 4.3.1 GST-ERK1表达蛋白纯化 | 第82-83页 |
| 4.3.2 PRM检测多肽实验流程 | 第83-84页 |
| 4.3.3 基于Tip的磷酸化富集 | 第84-85页 |
| 4.4 结果 | 第85-95页 |
| 4.4.1 GST-ERK1融合蛋白表达纯化 | 第85-86页 |
| 4.4.2 PRM方法的准确度和线性范围 | 第86页 |
| 4.4.3 FMRP靶向的基因且在蛋白水平上调的激酶分析 | 第86-91页 |
| 4.4.5 复杂样品中磷酸化占比分析 | 第91-92页 |
| 4.4.6 基于Tip的磷酸化富集结果 | 第92-95页 |
| 第五章 点击化学结合串联质谱方法富集新合成蛋白 | 第95-102页 |
| 5.1 背景介绍 | 第95-96页 |
| 5.2 实验方法 | 第96-100页 |
| 5.2.1 小鼠原代大脑皮层神经元培养 | 第96-97页 |
| 5.2.2 AHA标记方法 | 第97页 |
| 5.2.3 点击化学反应 | 第97-99页 |
| 5.2.4 新合成蛋白富集 | 第99-100页 |
| 5.3 结果 | 第100-102页 |
| 5.3.1 点击化学方法的建立 | 第100-101页 |
| 5.3.2 富集到的新合成蛋白 | 第101-102页 |
| 第六章 总结 | 第102-106页 |
| 6.1 讨论 | 第102-104页 |
| 6.1.1 FMRP影响PRKRA蛋白水平及磷酸化水平的可能分子机制 | 第102页 |
| 6.1.2 PRKRA磷酸化与FXS疾病的关系 | 第102-103页 |
| 6.1.3 磷酸化信号通路在脆性X染色体综合征中的作用 | 第103页 |
| 6.1.4 FMRP的翻译抑制作用与蛋白质组变化 | 第103页 |
| 6.1.5 新合成蛋白定量方法的优化 | 第103-104页 |
| 6.1.6 靶向质谱用于FXS的临床检测 | 第104页 |
| 6.2 本研究有待改进之处 | 第104-105页 |
| 6.3 总结 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-112页 |
| 附录 | 第112-140页 |
| 附录1 Fmr1KO小鼠大脑皮层蛋白质组上调蛋白列表 | 第112-117页 |
| 附录2 Fmr1KO小鼠大脑皮层蛋白组蛋白水平下调列表 | 第117-120页 |
| 附录3 Fmr1KO小鼠大脑皮层磷酸化水平上调列表 | 第120-132页 |
| 附录4 Fmr1KO小鼠大脑皮层磷酸化水平下调列表 | 第132-133页 |
| 附录5 Fmr1KO小鼠大脑皮层磷酸化上调位点二级质谱图及注释 | 第133-136页 |
| 附录6 缩略词表 | 第136-139页 |
| 附录7 博士期间工作成果 | 第139-140页 |
| 致谢 | 第140页 |
