| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-38页 |
| 1.1 葡萄糖氧化酶介绍 | 第18-22页 |
| 1.1.1 葡萄糖氧化酶催化机理 | 第19页 |
| 1.1.2 葡萄糖氧化酶特性 | 第19-20页 |
| 1.1.3 葡萄糖氧化酶组成 | 第20页 |
| 1.1.4 葡萄糖氧化酶酶活测量 | 第20-21页 |
| 1.1.5 葡萄糖氧化酶性质鉴定 | 第21-22页 |
| 1.1.5.1 底物特异性 | 第21页 |
| 1.1.5.2 最适pH与稳定性 | 第21页 |
| 1.1.5.3 最适温度与稳定性 | 第21-22页 |
| 1.1.5.4 酶浓度与反应初始速率 | 第22页 |
| 1.1.5.5 动力学参数的变化 | 第22页 |
| 1.1.5.6 储存稳定性 | 第22页 |
| 1.2 葡萄糖氧化酶的应用 | 第22-28页 |
| 1.2.1 葡萄糖氧化酶分离 | 第23-24页 |
| 1.2.2 葡萄糖氧化酶固定化 | 第24-26页 |
| 1.2.3 糖尿病检测 | 第26页 |
| 1.2.4 生物电池 | 第26页 |
| 1.2.5 食品与饮品添加剂 | 第26-27页 |
| 1.2.6 低酒精度饮料生产 | 第27-28页 |
| 1.2.7 口腔卫生 | 第28页 |
| 1.2.8 葡萄糖酸生产 | 第28页 |
| 1.2.9 纺织工业 | 第28页 |
| 1.3 发酵生产 | 第28-36页 |
| 1.3.1 生产菌株 | 第28-29页 |
| 1.3.2 酶蛋白生产参数 | 第29-35页 |
| 1.3.2.1 碳源 | 第29-30页 |
| 1.3.2.2 氮源 | 第30页 |
| 1.3.2.3 通氧和搅拌 | 第30-31页 |
| 1.3.2.5 生长温度 | 第31-32页 |
| 1.3.2.6 碳酸钙诱导剂 | 第32-33页 |
| 1.3.2.7 分批补料培养 | 第33页 |
| 1.3.2.8 其他培养基组分 | 第33-34页 |
| 1.3.2.9 统计学优化 | 第34页 |
| 1.3.2.10 数学模型 | 第34-35页 |
| 1.3.3 基因工程菌 | 第35-36页 |
| 1.4 本论文研究目的 | 第36页 |
| 1.5 本论文研究思路 | 第36-38页 |
| 第二章 葡萄糖氧化酶在酵母中合成 | 第38-45页 |
| 2.1 引言 | 第38页 |
| 2.2 实验工具与试剂 | 第38-39页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第38-39页 |
| 2.2.2 酶及生化试剂 | 第39页 |
| 2.2.3 培养基 | 第39页 |
| 2.3 实验方法 | 第39-42页 |
| 2.3.1 含有pMD-T-GOD-A质粒E.coli的复苏 | 第39-40页 |
| 2.3.2 GOD-A.niger(A)的大小验证 | 第40页 |
| 2.3.3 pPIC9K-GOD(A)质粒的构建 | 第40-41页 |
| 2.3.4 pPIC9K-GOD(A)-GS115菌株的构建 | 第41-42页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第42-44页 |
| 2.4.1 黑曲霉Z-25葡萄糖氧化酶(GOD-A)基因验证 | 第42-43页 |
| 2.4.2 黑曲霉Z-25葡萄糖氧化酶(GOD-A)酵母表达 | 第43-44页 |
| 2.5 小结 | 第44-45页 |
| 第三章 葡萄糖氧化酶分泌型基因工程菌构建 | 第45-76页 |
| 3.1 引言 | 第45-47页 |
| 3.2 实验材料与试剂 | 第47-48页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第47页 |
| 3.2.2 酶及生化试剂 | 第47-48页 |
| 3.2.3 培养基 | 第48页 |
| 3.3 实验方法 | 第48-53页 |
| 3.3.2 基因碎片化 | 第48页 |
| 3.3.3 GOD-A单基因定向进化 | 第48-50页 |
| 3.3.4 重组质粒pPIC9K-GOD-S的构建 | 第50页 |
| 3.3.5 GS115酵母转化 | 第50-51页 |
| 3.3.6 第二次单基因定向进化 | 第51页 |
| 3.3.7 GOD-A+P双基因定向进化 | 第51页 |
| 3.3.8 菌株改造：全局转录调控 | 第51-52页 |
| 3.3.9 自产葡萄糖氧化酶反应能力鉴定 | 第52页 |
| 3.3.10 转化子遗传学稳定性鉴定 | 第52-53页 |
| 3.3.11 毕赤酵母转化子目的基因拷贝数目鉴定 | 第53页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第53-75页 |
| 3.4.1 第一代菌株的筛选 | 第53-56页 |
| 3.4.2 第一代菌株第一次放大发酵验证酶活 | 第56-57页 |
| 3.4.3 第一代菌株第二次放大诱导曲线 | 第57-58页 |
| 3.4.4 第一代菌株的3L高密度发酵 | 第58-62页 |
| 3.4.4.1 酶活测定 | 第58-59页 |
| 3.4.4.2 蛋白量测定 | 第59-60页 |
| 3.4.4.3 比酶活测定 | 第60页 |
| 3.4.4.4 生物量测定 | 第60-61页 |
| 3.4.4.5 细胞干重测定 | 第61页 |
| 3.4.4.6 发酵时间延长实验 | 第61-62页 |
| 3.4.5 第二代菌株的筛选与高密度发酵 | 第62-68页 |
| 3.4.6 第三代菌株的构建(gTME) | 第68-73页 |
| 3.4.7 自产葡萄糖氧化酶反应鉴定 | 第73页 |
| 3.4.8 毕赤酵母转化子遗传稳定性的鉴定 | 第73-74页 |
| 3.4.9 毕赤酵母转化子目的基因拷贝数目鉴定 | 第74-75页 |
| 3.5 小结 | 第75-76页 |
| 第四章 葡萄糖氧化酶性质 | 第76-101页 |
| 4.1 引言 | 第76-77页 |
| 4.2 实验材料与试剂 | 第77页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第77页 |
| 4.2.2 生化试剂 | 第77页 |
| 4.2.3 培养基 | 第77页 |
| 4.3 实验方法 | 第77-79页 |
| 4.3.1 热稳定性改造 | 第77页 |
| 4.3.2 过氧化氢耐受性改造 | 第77-79页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第79-100页 |
| 4.4.1 原始葡萄糖氧化酶热稳性鉴定 | 第79-82页 |
| 4.4.2 热稳定性改造 | 第82-92页 |
| 4.4.3 葡萄糖氧化酶过氧化氢耐受性鉴定 | 第92-93页 |
| 4.4.4 过氧化氢酶的表达 | 第93-99页 |
| 4.4.5 共表达菌株构建 | 第99页 |
| 4.4.6 双功能酶构建 | 第99-100页 |
| 4.5 小结 | 第100-101页 |
| 第五章 结论 | 第101-103页 |
| 参考文献 | 第103-106页 |
| 附录 实验仪器及制造商 | 第106-108页 |
| 致谢 | 第108-110页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第110-112页 |
| 作者和导师简介 | 第112页 |
