| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 目录 | 第6-10页 |
| 1 引言 | 第10-23页 |
| 1.1 漆酶研究进展 | 第10-18页 |
| 1.1.1 漆酶资源研究 | 第10-11页 |
| 1.1.2 漆酶的性质及应用研究 | 第11-16页 |
| 1.1.2.1 漆酶的理化性质研究 | 第11-12页 |
| 1.1.2.2 漆酶活性分析研究 | 第12-13页 |
| 1.1.2.3 漆酶酶学性质的研究 | 第13-14页 |
| 1.1.2.4 漆酶的应用 | 第14-16页 |
| 1.1.3 漆酶基因的克隆与异源表达研究 | 第16-18页 |
| 1.1.3.1 漆酶基因的克隆研究 | 第16-17页 |
| 1.1.3.2 漆酶的异源表达研究 | 第17-18页 |
| 1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 | 第18-21页 |
| 1.2.1 巴斯德毕赤酵母表达的特点 | 第18-19页 |
| 1.2.2 巴斯德毕赤酵母表达系统启动子 | 第19-20页 |
| 1.2.3 发酵工艺 | 第20-21页 |
| 1.2.3.1 发酵调控 | 第20页 |
| 1.2.3.2 发酵方式 | 第20-21页 |
| 1.3 本研究目的和意义 | 第21-22页 |
| 1.4 本研究技术路线 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-41页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-29页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第23页 |
| 2.1.2 分子生物学常用酶和试剂(盒) | 第23-24页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第24页 |
| 2.1.4 常用培养基、试剂和缓冲液 | 第24-29页 |
| 2.1.4.1 常用培养基配方 | 第24-26页 |
| 2.1.4.2 质粒提取试剂 | 第26-27页 |
| 2.1.4.3 核酸电泳溶液 | 第27页 |
| 2.1.4.4 核酸和蛋白电泳溶液 | 第27-29页 |
| 2.1.4.5 酶活检测试剂 | 第29页 |
| 2.2 方法 | 第29-41页 |
| 2.2.1 枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取 | 第29-30页 |
| 2.2.2 引物设计 | 第30页 |
| 2.2.3 漆酶基因的克隆 | 第30-31页 |
| 2.2.3.1 PCR反应体系及反应条件 | 第30-31页 |
| 2.2.3.2 PCR反应产物的检测 | 第31页 |
| 2.2.3.3 PCR产物的琼脂糖凝胶回收 | 第31页 |
| 2.2.4 载体质粒的提取 | 第31页 |
| 2.2.5 目的基因及载体的双酶切 | 第31-32页 |
| 2.2.5.1 目的基因及pPIC9K的双酶切 | 第31-32页 |
| 2.2.5.2 连接产物pPIC9K-bslac2及pGAP9K的双酶切 | 第32页 |
| 2.2.6 连接与转化 | 第32-33页 |
| 2.2.6.1 目的基因与载体的连接 | 第32页 |
| 2.2.6.2 E. coli DH5a感受态的制备 | 第32-33页 |
| 2.2.6.3 转化 | 第33页 |
| 2.2.7 重组子的鉴定 | 第33-34页 |
| 2.2.7.1 质粒提取和酶切鉴定 | 第33-34页 |
| 2.2.7.2 阳性克隆及测序比对分析 | 第34页 |
| 2.2.7.3 重组子保存 | 第34页 |
| 2.2.8 重组质粒线性化 | 第34-35页 |
| 2.2.9 巴斯德毕赤酵母感受态的制备 | 第35页 |
| 2.2.10 电击杯清洗流程 | 第35页 |
| 2.2.11 电转化巴斯德毕赤酵母 | 第35页 |
| 2.2.12 重组子的筛选 | 第35-37页 |
| 2.2.12.1 菌液PCR法筛选 | 第35-36页 |
| 2.2.12.2 诱导型摇瓶表达 | 第36-37页 |
| 2.2.12.3 组成型摇瓶表达 | 第37页 |
| 2.2.12.4 平板活性检测 | 第37页 |
| 2.2.13 Mut表型筛选 | 第37页 |
| 2.2.14 高密度发酵 | 第37-38页 |
| 2.2.15 重组蛋白的检测 | 第38-39页 |
| 2.2.15.1 SDS-PAGE分析 | 第38页 |
| 2.2.15.2 重组蛋白的初步纯化 | 第38-39页 |
| 2.2.15.3 ABTS法精测漆酶酶活 | 第39页 |
| 2.2.16 漆酶酶学性质的分析 | 第39-41页 |
| 2.2.16.1 漆酶最适pH值测定 | 第39页 |
| 2.2.16.2 漆酶热稳定性的测定 | 第39页 |
| 2.2.16.3 铜离子浓度对漆酶的影响 | 第39-40页 |
| 2.2.16.4 芳香族化合物对漆酶的影响 | 第40-41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-60页 |
| 3.1 模板基因组DNA的提取 | 第41页 |
| 3.2 漆酶基因的扩增及扩增产物的回收 | 第41-42页 |
| 3.3 质粒载体的提取 | 第42页 |
| 3.4 构建表达载体 | 第42-44页 |
| 3.4.1 诱导型表达载体的构建 | 第42-43页 |
| 3.4.2 组成型表达载体的构建 | 第43-44页 |
| 3.5 重组子的鉴定 | 第44-48页 |
| 3.5.1 提取质粒 | 第44-45页 |
| 3.5.2 酶切鉴定 | 第45-46页 |
| 3.5.3 测序分析 | 第46-48页 |
| 3.6 表达载体线性化 | 第48-49页 |
| 3.7 重组子的筛选 | 第49-51页 |
| 3.7.1 菌落PCR筛选 | 第49-50页 |
| 3.7.2 平板活性检测 | 第50-51页 |
| 3.8 高活性重组子MUT表型鉴定 | 第51-52页 |
| 3.9 摇瓶表达 | 第52页 |
| 3.10 高密度发酵 | 第52-58页 |
| 3.10.1 高密度发酵GS115(pPIC9K-bslac2)表达漆酶 | 第52-54页 |
| 3.10.2 高密度发酵GS115(pGAP9K-bslac2)表达漆酶 | 第54-56页 |
| 3.10.6 漆酶的初步纯化 | 第56-58页 |
| 3.11 bslac2酶学性质的研究 | 第58-60页 |
| 3.11.1 bslac2最适pH值测定 | 第58页 |
| 3.11.2 bslac2最适温度测定 | 第58-59页 |
| 3.11.3 铜离子浓度对bslac2的影响 | 第59页 |
| 3.11.4 芳香族化合物对bslac2的影响 | 第59-60页 |
| 4 讨论 | 第60-63页 |
| 4.1 基因供体的选择和漆酶基因的克隆 | 第60页 |
| 4.2 漆酶的诱导表达 | 第60-61页 |
| 4.3 漆酶的规模化生产 | 第61页 |
| 4.5 展望 | 第61-63页 |
| 5 结论 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-71页 |
| 附录一 bslac2基因与基因编号为AL009126.3序列的比对 | 第71-73页 |
| 附录二 bslac2基因与编号AL009126.3基因翻译氨基酸的比对 | 第73-75页 |
| 附录三 缩写词(Abbreviation) | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
