| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 英文缩略表 | 第18-20页 |
| 第一章 引言 | 第20-36页 |
| 1.1 工业微生物育种技术 | 第20-21页 |
| 1.1.1 诱变育种 | 第20页 |
| 1.1.2 遗传育种 | 第20-21页 |
| 1.1.3 基因工程育种 | 第21页 |
| 1.2 芽孢杆菌表达系统概述 | 第21-22页 |
| 1.2.1 芽孢杆菌表达系统 | 第21-22页 |
| 1.2.2 芽孢杆菌表达系统特点 | 第22页 |
| 1.3 芽孢杆菌表达系统的遗传操作体系 | 第22-31页 |
| 1.3.1 芽孢杆菌表达系统宿主菌株 | 第23-24页 |
| 1.3.2 芽孢杆菌表达系统载体系统 | 第24-28页 |
| 1.3.3 芽孢杆菌表达系统转化方法 | 第28-31页 |
| 1.4 芽孢杆菌表达系统基因表达特点 | 第31-35页 |
| 1.4.1 启动子 | 第31-33页 |
| 1.4.2 信号肽和信号肽酶 | 第33页 |
| 1.4.3 终止子 | 第33-34页 |
| 1.4.4 外源蛋白的分泌表达 | 第34页 |
| 1.4.5 芽孢杆菌蛋白质分泌机制 | 第34页 |
| 1.4.6 影响蛋白分泌的因素 | 第34-35页 |
| 1.5 研究目的和意义 | 第35-36页 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌遗传操作体系的建立及其应用 | 第36-78页 |
| 第一节 枯草芽孢杆菌遗传操作体系的建立和完善 | 第36-66页 |
| 1.1 实验材料 | 第36-37页 |
| 1.1.1 菌株与载体 | 第36页 |
| 1.1.2 引物的合成与测序 | 第36页 |
| 1.1.3 试剂与仪器 | 第36页 |
| 1.1.4 培养基及溶液的配制 | 第36-37页 |
| 1.2 实验方法 | 第37-54页 |
| 1.2.1 引物设计 | 第37-39页 |
| 1.2.2 DNA片段的纯化或切胶回收 | 第39页 |
| 1.2.3 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第39页 |
| 1.2.4 大肠杆菌阳性重组子的鉴定 | 第39-40页 |
| 1.2.5 大肠杆菌质粒DNA的提取 | 第40页 |
| 1.2.6 芽孢杆菌基因组DNA的提取 | 第40-41页 |
| 1.2.7 芽孢杆菌对抗生素敏感性检测 | 第41页 |
| 1.2.8 枯草芽孢杆菌分泌表达载体的构建 | 第41-46页 |
| 1.2.9 枯草芽孢杆菌克隆载体的改造 | 第46-48页 |
| 1.2.10 枯草芽孢杆菌整合载体的构建 | 第48-52页 |
| 1.2.11 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第52-54页 |
| 1.3 结果与分析 | 第54-66页 |
| 1.3.1 芽孢杆菌对抗生素的敏感性检测试验 | 第54页 |
| 1.3.2 枯草芽孢杆菌分泌表达载体的构建 | 第54-58页 |
| 1.3.3 枯草芽孢杆菌克隆载体的改造 | 第58-60页 |
| 1.3.4 枯草芽孢杆菌整合载体的构建 | 第60-64页 |
| 1.3.5 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备 | 第64-66页 |
| 第二节 氨肽酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达 | 第66-77页 |
| 2.1 实验材料 | 第66页 |
| 2.1.1 菌株与载体 | 第66页 |
| 2.1.2 引物的合成与测序 | 第66页 |
| 2.1.3 试剂与仪器 | 第66页 |
| 2.1.4 培养基及溶液的配制 | 第66页 |
| 2.2 实验方法 | 第66-72页 |
| 2.2.1 B.subtilis基因组DNA的提取 | 第66-67页 |
| 2.2.2 氨肽酶基因lap B的克隆与序列分析 | 第67-68页 |
| 2.2.3 氨肽酶基因表达载体p BSlac-lap B的构建 | 第68-70页 |
| 2.2.4 氨肽酶活性的测定 | 第70-71页 |
| 2.2.5 氨肽酶重组表达菌株的摇瓶发酵试验 | 第71页 |
| 2.2.6 表达产物SDS-PAGE蛋白电泳分析 | 第71-72页 |
| 2.3 结果与分析 | 第72-75页 |
| 2.3.1 氨肽酶基因的克隆与序列分析 | 第72-73页 |
| 2.3.2 氨肽酶基因重组表达载体的构建 | 第73-74页 |
| 2.3.3 氨肽酶基因在枯草芽孢杆菌中的重组表达 | 第74-75页 |
| 2.3.4 重组氨肽酶表达产物的SDS-PAGE分析 | 第75页 |
| 2.4 讨论 | 第75-77页 |
| 本章小结 | 第77-78页 |
| 第三章 碱性蛋白酶基因在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达 | 第78-97页 |
| 3.1 实验材料 | 第78-79页 |
| 3.1.1 菌株与载体 | 第78页 |
| 3.1.2 引物合成与DNA测序 | 第78页 |
| 3.1.3 试剂与仪器 | 第78页 |
| 3.1.4 培养基及溶液的配制 | 第78-79页 |
| 3.2 实验方法 | 第79-88页 |
| 3.2.1 PCR引物 | 第79-80页 |
| 3.2.2 芽孢杆菌菌株的分子生物学鉴定 | 第80-81页 |
| 3.2.3 Bam HI甲基化酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达 | 第81-83页 |
| 3.2.4 解淀粉芽孢杆菌BF.7658 感受态细胞的制备 | 第83页 |
| 3.2.5 碱性蛋白酶酶活力测定 | 第83-85页 |
| 3.2.6 碱性蛋白酶基因apr E的克隆及序列分析 | 第85页 |
| 3.2.7 碱性蛋白酶基因表达载体的构建 | 第85-87页 |
| 3.2.8 解淀粉芽孢杆菌BF.7658 的转化 | 第87页 |
| 3.2.9 碱性蛋白酶重组表达菌株的摇瓶发酵试验 | 第87-88页 |
| 3.3 结果与分析 | 第88-94页 |
| 3.3.1 芽孢杆菌菌株的分子生物学鉴定 | 第88页 |
| 3.3.2 枯草芽孢杆菌B. subtilis WB600的遗传改良 | 第88-90页 |
| 3.3.3 碱性蛋白酶基因的克隆及序列分析 | 第90-92页 |
| 3.3.4 碱性蛋白酶基因表达载体的构建 | 第92页 |
| 3.3.5 碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的异源表达 | 第92-93页 |
| 3.3.6 碱性蛋白酶基因在解淀粉芽孢杆菌中的异源表达 | 第93-94页 |
| 3.4 讨论 | 第94-96页 |
| 本章小结 | 第96-97页 |
| 第四章 中性蛋白酶生产菌株的遗传改造 | 第97-115页 |
| 4.1 实验材料 | 第97-98页 |
| 4.1.1 菌株与载体 | 第97页 |
| 4.1.2 引物合成与DNA测序 | 第97页 |
| 4.1.3 试剂与仪器 | 第97页 |
| 4.1.4 培养基及溶液的配制 | 第97-98页 |
| 4.2 实验方法 | 第98-104页 |
| 4.2.1 PCR引物 | 第98-99页 |
| 4.2.2 中性蛋白酶酶活力测定 | 第99页 |
| 4.2.3 产中性蛋白酶菌株的分子鉴定 | 第99-100页 |
| 4.2.4 中性蛋白酶基因的克隆及序列分析 | 第100页 |
| 4.2.5 B. amyloliquefaciens K11中性蛋白酶基因表达载体的构建 | 第100-102页 |
| 4.2.6 中性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第102页 |
| 4.2.7 解淀粉芽孢杆菌感受态细胞的制备 | 第102-103页 |
| 4.2.8 中性蛋白酶基因在解淀粉芽孢杆菌中的表达 | 第103页 |
| 4.2.9 中性蛋白酶重组表达菌株的摇瓶发酵试验 | 第103页 |
| 4.2.10 重组质粒遗传稳定性分析 | 第103页 |
| 4.2.11 中性蛋白酶重组表达菌株摇瓶发酵条件优化 | 第103-104页 |
| 4.2.12 中性蛋白酶重组表达菌株发酵罐测试 | 第104页 |
| 4.2.13 中性蛋白酶部分酶学性质测定 | 第104页 |
| 4.3 结果与分析 | 第104-112页 |
| 4.3.1 产中性蛋白酶菌株的分子鉴定 | 第104-105页 |
| 4.3.2 中性蛋白酶基因的克隆 | 第105页 |
| 4.3.3 中性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的异源表达 | 第105页 |
| 4.3.4 中性蛋白酶基因在解淀粉芽孢杆菌中的过表达 | 第105-108页 |
| 4.3.5 重组质粒遗传稳定性分析 | 第108-110页 |
| 4.3.6 中性蛋白酶重组表达菌摇瓶发酵条件优化 | 第110-111页 |
| 4.3.7 中性蛋白酶重组表达菌 110N-6 发酵罐试验 | 第111页 |
| 4.3.8 中性蛋白酶酶学性质分析 | 第111-112页 |
| 4.4 讨论 | 第112-114页 |
| 本章小结 | 第114-115页 |
| 第五章 全文结论 | 第115-116页 |
| 参考文献 | 第116-126页 |
| 致谢 | 第126-127页 |
| 作者简历 | 第127页 |
