| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-11页 |
| 缩略语 | 第11-12页 |
| 第一章 NADH 还原酶的综述 | 第12-17页 |
| 引言 | 第12页 |
| 1 酶的发现 | 第12页 |
| 2 氧化还原酶的分类 | 第12页 |
| 3 线粒体复合体和NADH | 第12-14页 |
| 4 NADH 和NADH 辅酶的化学结构的关系 | 第14页 |
| 5 NADH-细胞色素b5 还原酶 | 第14-15页 |
| 6 NADH 突变引起的疾病 | 第15页 |
| 7 展望 | 第15-17页 |
| 第二章 实验方案设计 | 第17-18页 |
| 1 实验目的和意义 | 第17页 |
| 2 实验流程 | 第17-18页 |
| 第三章 生物信息学分析 | 第18-27页 |
| 1 生物信息学工具 | 第18页 |
| 2 结果与分析 | 第18-25页 |
| ·基因分析 | 第19页 |
| ·进行序列比对 | 第19页 |
| ·蛋白性质分析 | 第19-25页 |
| ·保守结构域分子 | 第19-20页 |
| ·跨膜结构分析 | 第20页 |
| ·疏水性分析 | 第20-21页 |
| ·BmNADHb5 蛋白定位的预测 | 第21页 |
| ·信号肽分析 | 第21-22页 |
| ·功能位点的预测 | 第22-23页 |
| ·BmNADHb5 类家族蛋白的同源分析 | 第23页 |
| ·进化树分析 | 第23-24页 |
| ·二级结构预测 | 第24-25页 |
| 3 讨论 | 第25-27页 |
| 第四章 BmNADHb5 的克隆、表达、纯化及抗体制备 | 第27-49页 |
| 1 材料与试剂 | 第27-32页 |
| ·材料 | 第27页 |
| ·试剂 | 第27页 |
| ·试剂的配制 | 第27-32页 |
| ·培养基 | 第27-28页 |
| ·碱裂解法提取质粒DNA 用溶液 | 第28-29页 |
| ·核酸电泳所用溶液 | 第29页 |
| ·SDS-PAGE 用试剂 | 第29-30页 |
| ·抗体纯化用试剂 | 第30-31页 |
| ·Bradford 检测用试剂 | 第31页 |
| ·抗体制备用试剂 | 第31页 |
| ·ELISA 试剂 | 第31-32页 |
| ·其他试剂 | 第32页 |
| 2 实验方法 | 第32-42页 |
| ·BmNADHb5 基因的克隆 | 第32-38页 |
| ·PCR 获得的ORF 序列 | 第32-33页 |
| ·PCR 产物与表达载体pET-28a(+)的双酶切 | 第33-34页 |
| ·酶切产物的纯化 | 第34页 |
| ·连接反应 | 第34页 |
| ·E.coli TG1、E.coli Rosetta 感受态细胞的制备 | 第34页 |
| ·连接产物的转化 | 第34-35页 |
| ·重组克隆的筛选与鉴定 | 第35页 |
| ·DNA 胶回收 | 第35-36页 |
| ·质粒提取 | 第36-37页 |
| ·基因序列的测定 | 第37-38页 |
| ·Bradford 法蛋白定量 | 第38页 |
| ·BmNADHb5 重组质粒在大肠杆菌中的表达 | 第38-40页 |
| ·融合蛋白的诱导表达 | 第38页 |
| ·SDS-PAGE 操作步骤 | 第38-40页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第40页 |
| ·抗体的制备 | 第40-42页 |
| ·抗原的制备 | 第40-41页 |
| ·免疫动物 | 第41页 |
| ·多克隆抗血清的制备 | 第41页 |
| ·抗体的纯化 | 第41-42页 |
| ·抗体的效价测定(ELISA) | 第42页 |
| 3 结果 | 第42-47页 |
| ·PCR 扩增目的片段 | 第42-43页 |
| ·重组质粒pET-28a(+)-BmNADHb5 的双酶切鉴定 | 第43页 |
| ·重组质粒测序结果 | 第43-44页 |
| ·蛋白诱导纯化 | 第44-45页 |
| ·处理包涵体 | 第45-46页 |
| ·抗体纯化图 | 第46页 |
| ·抗体的效价测定 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-49页 |
| 第五章 BmNADH 的表达分析及其分布 | 第49-64页 |
| 1 材料与试剂 | 第49-50页 |
| ·材料 | 第49页 |
| ·试剂 | 第49页 |
| ·试剂的配制 | 第49-50页 |
| ·抗体纯化用试剂 | 第49页 |
| ·Western blot 试剂 | 第49-50页 |
| 2 方法 | 第50-54页 |
| ·Western blot 检测 | 第50-51页 |
| ·总蛋白和RNA 的提取及定量 | 第51-52页 |
| ·总蛋白质的提取及定量 | 第51页 |
| ·总RNA 的提取 | 第51-52页 |
| ·反转录反应 | 第52页 |
| ·荧光定量PCR 检测BmNADHb5 在家蚕各组织的分布 | 第52-54页 |
| ·荧光定量PCR 的引物设计 | 第52-53页 |
| ·荧光定量PCR | 第53页 |
| ·荧光定量PCR 数据分析 | 第53-54页 |
| 3 实验结果与讨论 | 第54-63页 |
| ·抗体的Western blot 分析 | 第54页 |
| ·ELISA 半定量法和Western blot 检测各组织 | 第54-55页 |
| ·ELISA 半定量测定家蚕各时期中BmNADHb5 含量 | 第55-58页 |
| ·荧光定量PCR 技术对BmNADHb5 转录水平的分析 | 第58-63页 |
| 4 讨论 | 第63-64页 |
| 第六章 亚细胞定位 | 第64-68页 |
| 1 材料与试剂 | 第64-65页 |
| ·材料 | 第64页 |
| ·试剂 | 第64页 |
| ·试剂的配制 | 第64-65页 |
| 2 方法 | 第65-66页 |
| 3 结果 | 第66-67页 |
| 4 讨论 | 第67-68页 |
| 结论 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
