| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-18页 |
| 1.1 β-胡萝卜素简介 | 第10页 |
| 1.2 β-胡萝卜素的生理作用 | 第10-12页 |
| 1.2.1 消除活性氧自由基 | 第10-11页 |
| 1.2.2 安全的维生素A来源 | 第11页 |
| 1.2.3 增加细胞间的间隙交流 | 第11-12页 |
| 1.3 β-胡萝卜素的合成方法 | 第12-14页 |
| 1.3.1 化学合成途径 | 第12页 |
| 1.3.2 天然植物和微藻中提取 | 第12-13页 |
| 1.3.3 微生物发酵 | 第13页 |
| 1.3.4 基因工程 | 第13-14页 |
| 1.4 DNA assemble技术 | 第14-15页 |
| 1.5 表达 β-胡萝卜素的基因代谢工程研究 | 第15-16页 |
| 1.6 立项依据 | 第16-18页 |
| 第2章 β-胡萝卜素启动子组合调控 | 第18-30页 |
| 2.1 材料和仪器 | 第18-22页 |
| 2.1.1 菌种 | 第18-19页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第19页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第19-20页 |
| 2.1.4 主要培养基及溶液 | 第20页 |
| 2.1.5 引物 | 第20-22页 |
| 2.2 实验方法 | 第22-24页 |
| 2.2.1 基因组提取 | 第22页 |
| 2.2.2 高保真pcr扩增 | 第22页 |
| 2.2.3 凝胶回收方法 | 第22页 |
| 2.2.4 overlap PCR技术 | 第22-23页 |
| 2.2.5 DNA片段浓缩方法 | 第23页 |
| 2.2.6 酵母转化方法 | 第23页 |
| 2.2.7 发酵和培养 | 第23-24页 |
| 2.2.8 β-胡萝卜素的萃取及菌干重的测定 | 第24页 |
| 2.2.9 β-胡萝卜素的检测方法 | 第24页 |
| 2.3 结果 | 第24-28页 |
| 2.3.1 耶氏解脂酵母工程菌MYA2613-TGE和MYA2613-YGF的构建 | 第24-26页 |
| 2.3.2 工程菌株MYA2613-TGE和MYA2613-YGF的发酵结果 | 第26-28页 |
| 2.4 讨论 | 第28-30页 |
| 第3章 异源表达 β-胡萝卜素合酶 | 第30-37页 |
| 3.1 实验材料和仪器 | 第30-31页 |
| 3.1.1 菌株及基因组 | 第30页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第30页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第30页 |
| 3.1.4 主要培养基及溶液 | 第30页 |
| 3.1.5 引物 | 第30-31页 |
| 3.2 实验方法 | 第31-33页 |
| 3.2.1 基因组提取 | 第31页 |
| 3.2.2 高保真pcr扩增 | 第31页 |
| 3.2.3 凝胶回收方法 | 第31页 |
| 3.2.4 温度梯度PCR技术 | 第31-32页 |
| 3.2.5 DNA片段浓缩及转化 | 第32页 |
| 3.2.6 酵母转化方法 | 第32页 |
| 3.2.7 酵母菌落pcr | 第32页 |
| 3.2.8 发酵和培养 | 第32页 |
| 3.2.9 β-胡萝卜素的萃取方法及菌干重的测定 | 第32-33页 |
| 3.2.10 β-胡萝卜素的检测方法 | 第33页 |
| 3.3 实验结果 | 第33-35页 |
| 3.3.1 温度梯度pcr探究最适退火温度 | 第33页 |
| 3.3.2 工程菌MYA2613-DD和MYA2613k7080-DD的构建与筛选 | 第33-35页 |
| 3.3.3 工程菌株MYA2613-DD和MYA2613ku7080-DD的发酵结果 | 第35页 |
| 3.4 讨论 | 第35-37页 |
| 第4章 增强乙酰辅酶A供应 | 第37-53页 |
| 4.1 实验材料和仪器 | 第38-40页 |
| 4.1.1 菌种和质粒 | 第38页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第38页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第38-39页 |
| 4.1.4 主要培养基及溶液 | 第39页 |
| 4.1.5 引物 | 第39-40页 |
| 4.2 实验方法 | 第40-45页 |
| 4.2.1 乙醇补料发酵 | 第40-41页 |
| 4.2.2 β-胡萝卜素的萃取及菌干重的测定 | 第41页 |
| 4.2.3 β-胡萝卜素的检测方法 | 第41页 |
| 4.2.4 基因组提取 | 第41页 |
| 4.2.5 高保真pcr扩增 | 第41-42页 |
| 4.2.6 凝胶回收方法 | 第42页 |
| 4.2.7 overlap PCR技术 | 第42页 |
| 4.2.8 Gibson拼接方法 | 第42页 |
| 4.2.9 限制性内切酶的酶切体系 | 第42-43页 |
| 4.2.10 T4DNA连接法 | 第43页 |
| 4.2.11 Ecoli.DH5α 感受态细胞的制备 | 第43页 |
| 4.2.12 Ecoli.DH5α 感受态细胞的转化 | 第43-44页 |
| 4.2.13 大肠杆菌的菌落pcr | 第44页 |
| 4.2.14 大肠杆菌的质粒抽提 | 第44页 |
| 4.2.15 酵母转化，发酵和培养以及产物 β-胡萝卜素的检测 | 第44页 |
| 4.2.16 ura3标记的回收 | 第44-45页 |
| 4.3 结果 | 第45-52页 |
| 4.3.1 乙醇补料发酵 | 第45页 |
| 4.3.2 erg10基因表达质粒的构建 | 第45-47页 |
| 4.3.3 ACl基因表达质粒的构建 | 第47-49页 |
| 4.3.4 工程菌CIBTS1631-ACL和CIBTS1631-erg10的构建 | 第49页 |
| 4.3.5 工程菌CIBTS1631-ACL和CIBTS1631-erg10发酵和产物萃取 | 第49-50页 |
| 4.3.6 工程菌CIBTS1631-erg10-ACL的构建 | 第50-51页 |
| 4.3.7 工程菌CIBTS1631-erg10-ACL的发酵和产物萃取 | 第51-52页 |
| 4.4 讨论 | 第52-53页 |
| 第5章 工程菌双倍体的构建 | 第53-72页 |
| 5.1 菌株及质粒 | 第53-56页 |
| 5.1.1 菌种 | 第53页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第53-54页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第54页 |
| 5.1.4 主要培养基及溶液 | 第54-55页 |
| 5.1.5 引物 | 第55-56页 |
| 5.2 实验方法 | 第56-58页 |
| 5.2.1 基因组提取 | 第56页 |
| 5.2.2 高保真pcr扩增 | 第56页 |
| 5.2.3 凝胶回收方法 | 第56页 |
| 5.2.4 overlap PCR技术 | 第56-57页 |
| 5.2.5 Gibson拼接方法 | 第57页 |
| 5.2.6 限制性内切酶的酶切体系 | 第57页 |
| 5.2.7 T4DNA连接法 | 第57页 |
| 5.2.8 Ecoli.DH5α 感受态细胞的制备和转化方法 | 第57页 |
| 5.2.9 大肠杆菌的菌落pcr | 第57页 |
| 5.2.10 大肠杆菌的质粒抽提 | 第57页 |
| 5.2.11 酵母转化，发酵和培养以及产物 β-胡萝卜素的检测 | 第57页 |
| 5.2.12 酵母菌落pcr | 第57-58页 |
| 5.2.13 单倍体酵母mating方法 | 第58页 |
| 5.2.14 双倍体酵母再验证 | 第58页 |
| 5.2.15 ura3标记的回收 | 第58页 |
| 5.3 实验结果 | 第58-69页 |
| 5.3.1 matB基因敲入质粒的构建 | 第58-60页 |
| 5.3.2 CIBTS1631-matA-matB工程菌的构建 | 第60页 |
| 5.3.3 质粒pCAS2yl-matA的构建 | 第60-62页 |
| 5.3.4 CIBTS1631-matB-ura-leu工程菌的构建 | 第62-63页 |
| 5.3.5 CIBTS1631-matB-ura工程菌的构建 | 第63页 |
| 5.3.6 CIBTS1631-leu工程菌的构建 | 第63-64页 |
| 5.3.7 CIBTS1631-leu和CIBTS1631-matB-ura的发酵和产物萃取 | 第64-65页 |
| 5.3.8 工程菌CIBTS1631-leu和CIBTS1631-matB-ura的接合试验 | 第65页 |
| 5.3.9 工程菌CIBTS1631双倍体稳定性试验 | 第65-66页 |
| 5.3.10 工程菌CIBTS1631双倍体菌落pcr验证 | 第66-67页 |
| 5.3.11 多组结合试验 | 第67-69页 |
| 5.4 讨论 | 第69-72页 |
| 第6章 总结和展望 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-77页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
