| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 英文缩略表 | 第8-12页 |
| 前言 | 第12-13页 |
| 第一部分 文献综述 | 第13-22页 |
| 第一章 支原体学及牛支原体概述 | 第13-17页 |
| 1.1 支原体的分类 | 第13页 |
| 1.2 支原体的化学组成、致病性及致病机制 | 第13-14页 |
| 1.2.1 化学组成 | 第13页 |
| 1.2.2 支原体的致病性及致病机制 | 第13-14页 |
| 1.3 支原体或其LAMPs诱导宿主细胞免疫应答的研究 | 第14-15页 |
| 1.4 牛支原体概述 | 第15-17页 |
| 1.4.1 M.bovis的生物学特性 | 第15页 |
| 1.4.2 M.bovis的病理特征及流行病学 | 第15-17页 |
| 第二章 转录组学及其研究方法概述 | 第17-22页 |
| 2.1 转录组学概述 | 第17页 |
| 2.2 转录组学研究方法及其在病原与宿主相互作用方面的应用 | 第17-22页 |
| 2.2.1 基于杂交的微阵列技术 | 第18-19页 |
| 2.2.2 基于测序技术的研究方法 | 第19-22页 |
| 第二部分 研究内容 | 第22-65页 |
| 第一章 对M.bovis LAMPs刺激后的EBL细胞进行转录组测序 | 第22-47页 |
| 1.1 实验材料 | 第22-23页 |
| 1.1.1 支原体菌株及细胞 | 第22页 |
| 1.1.2 主要试剂及仪器 | 第22-23页 |
| 1.2 实验方法 | 第23-31页 |
| 1.2.1 主要试剂配制 | 第23-24页 |
| 1.2.2 M.bovis Hubei-1 株培养、LAMPs提取及其浓度测定 | 第24-25页 |
| 1.2.3 EBL细胞的培养 | 第25页 |
| 1.2.4 EBL细胞IL-1β m RNA水平检测 | 第25-27页 |
| 1.2.5 M.bovis LAMPs诱导EBL细胞释放IL-1β 最佳时间和最佳剂量确定 | 第27页 |
| 1.2.6 RNA-seq样品制备及测序 | 第27-28页 |
| 1.2.7 测序数据质量控制及生物信息学分析 | 第28-29页 |
| 1.2.8 转录组整体质量评估 | 第29-30页 |
| 1.2.9 表达差异分析 | 第30页 |
| 1.2.10 差异基因表达模式聚类 | 第30页 |
| 1.2.11 差异基因GO注释及GO富集分析 | 第30-31页 |
| 1.2.12 差异基因KEGG通路富集分析及差异基因KEGG通路可视化 | 第31页 |
| 1.3 实验结果 | 第31-45页 |
| 1.3.1 M.bovis LAMPs诱导EBL细胞释放IL-1β 的最佳诱导时间和最佳诱导剂量 | 第31-32页 |
| 1.3.2 总RNA质量控制 | 第32-33页 |
| 1.3.3 原始测序数据及其质量控制 | 第33-34页 |
| 1.3.4 与参考基因组比对的mapping比率 | 第34页 |
| 1.3.5 转录组整体质量评估 | 第34-35页 |
| 1.3.6 样品表达量分析 | 第35页 |
| 1.3.7 表达差异分析 | 第35页 |
| 1.3.8 差异表达基因聚类分析 | 第35-36页 |
| 1.3.9 差异表达基因相互作用分析 | 第36-37页 |
| 1.3.10 差异表达基因GO分类统计 | 第37-38页 |
| 1.3.11 差异表达基因GO富集分析 | 第38-41页 |
| 1.3.12 差异表达基因KEGG富集及KEGG通路可视化分析 | 第41-44页 |
| 1.3.13 荧光定量PCR验证差异基因表达 | 第44-45页 |
| 1.4 讨论 | 第45-46页 |
| 1.5 小结 | 第46-47页 |
| 第二章 PIM2基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备 | 第47-58页 |
| 2.1 实验材料 | 第47页 |
| 2.1.1 支原体菌株、细胞及载体 | 第47页 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 | 第47页 |
| 2.2 实验方法 | 第47-53页 |
| 2.2.1 主要试剂配制 | 第47-48页 |
| 2.2.2 引物设计及合成 | 第48-49页 |
| 2.2.3 PCR反应条件及反应体系 | 第49-50页 |
| 2.2.4 PCR产物纯化、p EASY-Blunt-PIM2克隆载体构建及鉴定 | 第50-51页 |
| 2.2.5 p ET-28a-PIM2重组质粒构建及鉴定 | 第51页 |
| 2.2.6 p ET-28a-PIM2重组质粒的转化、表达及鉴定 | 第51-52页 |
| 2.2.7 rp-PIM2诱导条件的优化 | 第52页 |
| 2.2.8 rp-PIM2可溶性判断 | 第52-53页 |
| 2.2.9 rp-PIM2的纯化 | 第53页 |
| 2.2.10 rp-PIM2多克隆抗体制备 | 第53页 |
| 2.3 实验结果 | 第53-56页 |
| 2.3.1 PIM2基因的克隆及p EASY-Blunt-PIM2质粒构建 | 第53页 |
| 2.3.2 PIM2基因序列分析 | 第53页 |
| 2.3.3 p ET-28a-PIM2质粒构建及鉴定 | 第53-56页 |
| 2.3.4 rp-PIM2的诱导表达、纯化及鉴定 | 第56页 |
| 2.4 讨论 | 第56-57页 |
| 2.5 小结 | 第57-58页 |
| 第三章 PIM2亚细胞定位及其对EBL细胞释放IL-1β 影响初步研究 | 第58-65页 |
| 3.1 实验材料 | 第58页 |
| 3.1.1 支原体菌株、细胞及载体 | 第58页 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 | 第58页 |
| 3.2 实验方法 | 第58-60页 |
| 3.2.1 PCR反应体系及反应条件 | 第58页 |
| 3.2.2 PCR产物纯化、p EGFP-C1-PIM2及p CMV-C-HA-PIM2质粒构建 | 第58页 |
| 3.2.3 重组p EGFP-C1-PIM2及p CMV-C-HA-PIM2质粒的鉴定 | 第58-59页 |
| 3.2.4 EBL细胞培养及脂质体介导的细胞转染 | 第59页 |
| 3.2.5 PIM2基因瞬时表达产物的亚细胞定位 | 第59页 |
| 3.2.6 PIM2基因对EBL细胞释放IL-1β 的影响 | 第59-60页 |
| 3.3 实验结果 | 第60-63页 |
| 3.3.1 重组p EGFP-C1-PIM2、p CMV-C-HA-PIM2质粒构建及鉴定 | 第60-62页 |
| 3.3.2 PIM2基因亚细胞定位 | 第62页 |
| 3.3.3 PIM2基因对EBL细胞释放IL-1β 的影响 | 第62-63页 |
| 3.4 讨论 | 第63页 |
| 3.5 小结 | 第63-65页 |
| 结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-71页 |
| 附录 | 第71-77页 |
| 作者简介 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
