| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 一、引言 | 第13-20页 |
| 1.1 拟南芥中的重要脂质 | 第13-14页 |
| 1.1.1 三酰甘油(TAG) | 第13页 |
| 1.1.2 磷脂(phospholipids) | 第13-14页 |
| 1.1.3 拟南芥中三酰甘油和磷脂的相互转化 | 第14页 |
| 1.2 植物中的磷脂酶 | 第14-17页 |
| 1.2.1 植物中磷脂酶的分类 | 第14-15页 |
| 1.2.2 拟南芥pPLA家族分类及功能 | 第15-16页 |
| 1.2.3 拟南芥pPLAⅡα的研究 | 第16-17页 |
| 1.3 拟南芥粘液层 | 第17-19页 |
| 1.3.1 种皮的功能及结构 | 第17页 |
| 1.3.2 粘液层形成过程 | 第17-18页 |
| 1.3.3 参与粘液层合成的转录因子 | 第18页 |
| 1.3.4 GL2转录因子 | 第18-19页 |
| 1.4 立题依据 | 第19-20页 |
| 二、实验材料 | 第20-27页 |
| 2.1 植物材料 | 第20页 |
| 2.2 载体及菌种 | 第20页 |
| 2.3 化学试剂 | 第20页 |
| 2.4 工具酶 | 第20页 |
| 2.5 试剂盒 | 第20页 |
| 2.6 常用缓冲液和提取缓冲液 | 第20-24页 |
| 2.7 培养基 | 第24-25页 |
| 2.8 PCR反应引物合成和DNA测序 | 第25-26页 |
| 2.9 仪器设备 | 第26-27页 |
| 三、实验方案 | 第27-40页 |
| 3.1 pPLAⅡα启动子克隆及载体构建 | 第27-28页 |
| 3.1.1 pPLAⅡα启动子克隆 | 第27页 |
| 3.1.2 目的片段与pBluscript SK连接 | 第27页 |
| 3.1.3 连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α感受态 | 第27页 |
| 3.1.4 阳性菌落质粒提取 | 第27-28页 |
| 3.1.5 Promoter∷GUS重组质粒的构建 | 第28页 |
| 3.2 Promoter∷GUS转基因拟南芥获取 | 第28-29页 |
| 3.2.1 重组质粒转化农杆菌GV3101感受态 | 第28页 |
| 3.2.2 拟南芥无菌苗获取 | 第28-29页 |
| 3.2.3 浸花法转化拟南芥 | 第29页 |
| 3.2.4 转基因拟南芥阳性植株的鉴定 | 第29页 |
| 3.3 染色分析GUS报告基因活性 | 第29页 |
| 3.4 pPLAⅡα转基因拟南芥种子油脂含量分析 | 第29-31页 |
| 3.4.1 pPLAⅡα-OE转基因拟南芥制备 | 第29页 |
| 3.4.2 pPLAⅡα-KO突变体筛选 | 第29-30页 |
| 3.4.3 油脂含量的测定 | 第30-31页 |
| 3.5 拟南芥种子粘液层分析 | 第31-32页 |
| 3.5.1 拟南芥种子粘液层钌红染色及体积计算 | 第31页 |
| 3.5.2 拟南芥种子RNA提取 | 第31页 |
| 3.5.3 qRT-PCR分析基因在粘液层形成过程的表达模式 | 第31-32页 |
| 3.6 酵母单杂交实验验证启动子与转录因子结合 | 第32-34页 |
| 3.6.1 酵母Y1HGold感受态制备 | 第32页 |
| 3.6.2 重组质粒转化酵母感受态 | 第32页 |
| 3.6.3 目的基因整合至酵母基因组及检测 | 第32-33页 |
| 3.6.4 AbA抑制浓度检测 | 第33页 |
| 3.6.5 启动子与转录因子相互作用验证 | 第33-34页 |
| 3.7 蛋白原核表达及纯化 | 第34-36页 |
| 3.7.1 原核表达蛋白诱导 | 第34页 |
| 3.7.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE检测 | 第34页 |
| 3.7.3 原核表达蛋白可溶性检测 | 第34页 |
| 3.7.4 可溶性His融合蛋白小量纯化 | 第34-35页 |
| 3.7.5 Western blot验证目的蛋白 | 第35页 |
| 3.7.6 His融合蛋白大量纯化 | 第35页 |
| 3.7.7 BIO-RAD试剂法测定纯化蛋白浓度测定 | 第35-36页 |
| 3.8 EMSA实验验证启动子与结合元件结合 | 第36-38页 |
| 3.8.1 EMSA实验L1-Like box探针制备 | 第36-37页 |
| 3.8.2 LightShift Chemiluminescent EMSA Kit探针显影 | 第37-38页 |
| 3.8.3 EMSA实验验证GL2HD-ZIP domain与L1-Like box | 第38页 |
| 3.9 Fat Western blot验证蛋白与磷脂酸结合 | 第38-39页 |
| 3.10 酵母双杂交验证蛋白之间相互作用 | 第39-40页 |
| 3.10.1 自激活检测 | 第39页 |
| 3.10.2 酵母双杂交实验 | 第39-40页 |
| 四、实验结果 | 第40-51页 |
| 4.1 pPLAⅡα启动子在拟南芥组织中的表达活性分析 | 第40页 |
| 4.2 pPLAⅡα基因扩增 | 第40-41页 |
| 4.3 转基因拟南芥及突变体鉴定 | 第41-42页 |
| 4.4 pPLAⅡα转基因拟南芥油脂含量测定 | 第42页 |
| 4.5 pPLAⅡα在种子粘液层发育时期表达分析 | 第42-43页 |
| 4.6 pPLAⅡα参与拟南芥种子粘液层形成 | 第43-44页 |
| 4.7 pPLAⅡα位于GL2下游 | 第44-45页 |
| 4.8 pPLAⅡα启动子序列分析 | 第45-46页 |
| 4.9 酵母单杂交验证pPLAⅡα启动子可以与GL2直接结合 | 第46-47页 |
| 4.10 EMSA验证GL2与pPLAⅡα启动子的互作 | 第47-48页 |
| 4.10.1 GL2HD-ZIP domain蛋白诱导及纯化 | 第47页 |
| 4.10.2 EMSA实验验证GL2与pPLAⅡα启动子中类L1-box的相互作用 | 第47-48页 |
| 4.11 Fat Western blot验证GL2START domain与PA互作 | 第48-49页 |
| 4.12 酵母双杂交验证GL2与At5g60470相互作用 | 第49-51页 |
| 五、讨论 | 第51-54页 |
| 参考文献 | 第54-59页 |
| 附录 | 第59-60页 |
| 攻读硕士期间参与发表论文 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61页 |
