| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-22页 |
| 1.1 蛋白酶的分类、特性与应用 | 第10-13页 |
| 1.1.1 蛋白酶与分类 | 第10页 |
| 1.1.2 蛋白酶的结构与催化特点 | 第10-12页 |
| 1.1.2.1 金属蛋白酶 | 第10-11页 |
| 1.1.2.2 半胱氨酸蛋白酶 | 第11页 |
| 1.1.2.3 天冬氨酸蛋白酶 | 第11页 |
| 1.1.2.4 丝氨酸蛋白酶 | 第11-12页 |
| 1.1.3 蛋白酶的应用与生产现状 | 第12-13页 |
| 1.1.3.1 蛋白酶的应用 | 第12-13页 |
| 1.1.3.2 蛋白酶的工业生产现状 | 第13页 |
| 1.2 产蛋白酶微生物的遗传育种研究进展 | 第13-15页 |
| 1.2.1 蛋白酶发酵菌株的诱变育种 | 第13-14页 |
| 1.2.2 蛋白酶发酵菌株的基因工程育种 | 第14-15页 |
| 1.3 蛋白酶发酵工艺的优化 | 第15-16页 |
| 1.3.1 响应曲面法 | 第15-16页 |
| 1.3.2 响应曲面法在蛋白酶发酵工艺优化中的应用 | 第16页 |
| 1.4 B. subtilis的中性蛋白酶A | 第16-19页 |
| 1.4.1 中性蛋白酶A的编码基因 | 第16-17页 |
| 1.4.2 中性蛋白酶A的分泌 | 第17-18页 |
| 1.4.3 中性蛋白酶A的结构和催化特性 | 第18-19页 |
| 1.5 蛋白酶活性的测定方法 | 第19-20页 |
| 1.5.1 福林酚法 | 第19页 |
| 1.5.2 考马斯亮蓝法 | 第19-20页 |
| 1.5.3 甲醛滴定法 | 第20页 |
| 1.6 本文的研究的意义与内容 | 第20-22页 |
| 1.6.1 研究意义 | 第20-21页 |
| 1.6.2 研究内容 | 第21-22页 |
| 第二章 材料与方法 | 第22-37页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-30页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第22-23页 |
| 2.1.2 PCR引物 | 第23页 |
| 2.1.3 主要药品 | 第23-26页 |
| 2.1.4 主要试剂 | 第26-28页 |
| 2.1.5 培养基 | 第28页 |
| 2.1.6 主要仪器 | 第28-30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-37页 |
| 2.2.1 B. subtilis染色体DNA的提取 | 第30页 |
| 2.2.2 CTAB法提取质粒 | 第30页 |
| 2.2.3 PCR扩增反应 | 第30-31页 |
| 2.2.4 重叠PCR方法 | 第31-32页 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 | 第32页 |
| 2.2.6 DNA双酶切 | 第32页 |
| 2.2.7 DNA酶切连接 | 第32页 |
| 2.2.8 B. subtillis感受态细胞的制备与转化 | 第32-33页 |
| 2.2.9 E. coli感受态细胞的制备 | 第33页 |
| 2.2.10 E. coli的转化 | 第33-34页 |
| 2.2.11 菌种的保藏 | 第34页 |
| 2.2.12 L-酪氨酸标准曲线的绘制 | 第34-35页 |
| 2.2.13 蛋白酶活性测定 | 第35页 |
| 2.2.14 摇瓶发酵培养 | 第35-36页 |
| 2.2.15 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备 | 第36-37页 |
| 第三章 结果与分析 | 第37-57页 |
| 3.1 中性蛋白酶A表达质粒pHP13N的构建 | 第37-40页 |
| 3.2 质粒pHP13N的转化及产中性蛋白酶A菌株的筛选 | 第40-42页 |
| 3.3 产中性蛋白酶A重组菌株发酵培养基组分的单因素筛选 | 第42-48页 |
| 3.3.1 中性蛋白酶A发酵培养基有机氮源的筛选 | 第43-44页 |
| 3.3.2 中性蛋白酶A发酵培养基碳源的筛选 | 第44-46页 |
| 3.3.3 无机盐对中性蛋白酶A酶发酵的影响 | 第46-47页 |
| 3.3.4 磷酸钾缓冲液与Tween-80对中性蛋白酶A发酵的影响 | 第47-48页 |
| 3.4 Plackett-Burman试验设计筛选培养基组分的显著因素 | 第48-50页 |
| 3.5 最陡爬坡试验与响应曲面优化 | 第50-55页 |
| 3.5.1 最陡爬坡试验 | 第50-51页 |
| 3.5.2 中心组合响应面试验设计 | 第51-53页 |
| 3.5.3 响应面分析 | 第53-55页 |
| 3.6 蛋白酶发酵液的SDS-PAGE分析 | 第55-57页 |
| 第四章 结论与展望 | 第57-59页 |
| 4.1 主要结论 | 第57页 |
| 4.2 展望 | 第57-59页 |
| 参考文献 | 第59-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
