| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-13页 |
| 第1章 绪论 | 第13-29页 |
| ·研究背景 | 第13-29页 |
| ·PHF6与Borjeson-Forssman-Lehmann综合征(BFLS)疾病,T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)和急性髓细胞白血病(AML) | 第13-19页 |
| ·PHF6与Borjeson-Forssman-Lehmann综合征疾病 | 第13-18页 |
| ·PHF6与急性白血病 | 第18-19页 |
| ·Mi-2/NuRD(Nucleosome Remodeling and Deacetylation)复合物 | 第19-26页 |
| ·PHF6与Mi-2/NuRD复合物的相互作用 | 第26-28页 |
| ·PHF6与核糖体RNA(rRNA)的生物合成 | 第28-29页 |
| 第2章 实验材料与方法 | 第29-65页 |
| ·人源PHF6和RBBP4/RbAp48的克隆 | 第29-45页 |
| ·蛋白质边界选择 | 第29页 |
| ·目的蛋白基因的扩增 | 第29-31页 |
| ·目的基因片段核酸电泳 | 第31-32页 |
| ·目的基因片段的胶回收 | 第32-33页 |
| ·质粒DNA的抽提 | 第33-34页 |
| ·基因片段、载体质粒的双酶切与回收 | 第34-36页 |
| ·酶切片段与载体连接 | 第36页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第36-37页 |
| ·连接产物或质粒转化大肠杆菌感受态细胞 | 第37-38页 |
| ·菌落PCR鉴定与测序 | 第38-39页 |
| ·突变体的构建 | 第39-40页 |
| ·RBBP4重组Bacmid的构建 | 第40-41页 |
| ·RBBP4重组Bacmid的鉴定与提取 | 第41-42页 |
| ·High Five~(TM)昆虫细胞(BT1-Tn-581-4 Insect cells)的复苏培养和冻存 | 第42-43页 |
| ·重组杆状病毒的获得 | 第43-45页 |
| ·PHF6和RBBP4/RbAp48蛋白的表达与粗纯化 | 第45-48页 |
| ·PHF6蛋白的表达与粗纯化 | 第45-47页 |
| ·RBBP4/RbAp48蛋白的表达与粗纯化 | 第47-48页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第48-50页 |
| ·分子筛与离子交换 | 第50-51页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第51页 |
| ·相互作用实验 | 第51-55页 |
| ·GST pull down实验 | 第51-52页 |
| ·凝胶迁移实验(EMSA) | 第52-53页 |
| ·荧光偏振实验(FPA) | 第53-54页 |
| ·Western blotting | 第54-55页 |
| ·ITC实验 | 第55页 |
| ·核磁实验 | 第55-60页 |
| ·同位素标记PHF6 ePHD2结构域 | 第56页 |
| ·标记样品记核磁谱 | 第56页 |
| ·标记样品的冻干重溶 | 第56页 |
| ·核磁谱图处理与化学位移指认 | 第56-58页 |
| ·核磁共振约束指认(NOE和二面角约束) | 第58页 |
| ·主链弛豫常数的测定 | 第58-59页 |
| ·RDC定向介质的制备 | 第59-60页 |
| ·蛋白结晶,数据收集与结构解析 | 第60-61页 |
| ·蛋白质的结晶 | 第60页 |
| ·晶体衍射数据收集、处理与结构解析 | 第60-61页 |
| ·哺乳细胞的培养与转染 | 第61-62页 |
| ·免疫共沉淀(co-IP) | 第62-63页 |
| ·shRNA敲低(knockdown)基因 | 第63-65页 |
| 第3章 PHF6蛋白extended PHD2结构域的结构功能研究 | 第65-93页 |
| ·实验结果 | 第65-87页 |
| ·PHF6蛋白extended PHD结构域边界的选择 | 第65页 |
| ·PHF6蛋白的克隆,表达,纯化 | 第65-71页 |
| ·PHF6 ePHD2结构域的主链动力学分析 | 第71页 |
| ·PHF6 extended PHD2结构域与组蛋白的相互作用 | 第71-72页 |
| ·PHF6 extended PHD2结构域的晶体生长,数据收集与结构解析 | 第72-75页 |
| ·PHF6 extended PHD2结构域的晶体结构 | 第75页 |
| ·PHF6 extended PHD2结构域折叠成一个整体 | 第75-77页 |
| ·PHF6 extended PHD2结构域代表一种新的结构模块 | 第77-79页 |
| ·PHF6 extended PHD2结构域非特异性结合双链DNA | 第79-84页 |
| ·PHF6 extended PHD2结构域中的病理性点突变 | 第84-86页 |
| ·PHF6与NuRD复合物组分RBBP4直接相互作用 | 第86-87页 |
| ·PHF6介导的转录抑制依赖于其与RBBP4的相互作用 | 第87页 |
| ·讨论 | 第87-90页 |
| ·PHF6的extended PHD结构域代表一种新的结构模块 | 第87-89页 |
| ·BFLS,AML,T-ALL疾病中PHF6突变的影响 | 第89页 |
| ·PHF6与NuRD复合物组分RBBP4的直接相互作用对PHF6功能的提示 | 第89-90页 |
| ·总结 | 第90-93页 |
| 第4章 PHF6与RBBP4相互作用的结构与功能研究 | 第93-107页 |
| ·实验结果 | 第93-103页 |
| ·重组RBBP4/RbAp48蛋白的表达与纯化 | 第93-94页 |
| ·RBBP4与PHF6(157-171 aa)小肽的等温滴定量热(ITC)实验 | 第94-95页 |
| ·RBBP4与PHF6小肽复合物晶体的获得与结构解析 | 第95-97页 |
| ·RBBP4与PHF6小肽间的相互作用细节 | 第97-98页 |
| ·PHF6的突变对RBBP4识别的影响 | 第98-100页 |
| ·RBBP4-PHF6复合物与其他RBBP4/RbAp46复合物的结构比较 | 第100-102页 |
| ·PHF6的中间无序区域足以介导转录抑制,且是RBBP4中等程度依赖的 | 第102-103页 |
| ·讨论 | 第103-105页 |
| ·PHF6-RBBP4间的相互作用是高度保守的 | 第104页 |
| ·PHF6,FOG1和组蛋白H3与RBBP4的相互作用是相互排斥的 | 第104-105页 |
| ·PHF6的突变可能影响受NuRD复合物调控的发育相关通路 | 第105页 |
| ·总结 | 第105-107页 |
| 参考文献 | 第107-113页 |
| 附录1 | 第113-114页 |
| 附录2 | 第114-115页 |
| 附录3 | 第115-159页 |
| 致谢 | 第159-161页 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果 | 第161页 |
