| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-32页 |
| ·引言 | 第13-14页 |
| ·研究背景 | 第14-21页 |
| ·肝素/HS的结构和生物学功能 | 第14-15页 |
| ·肝素/HS的生物合成 | 第15-16页 |
| ·肝素合成前体(heparosan) | 第16-17页 |
| ·大肠杆菌K5合成heparosan的相关酶的研究 | 第17-19页 |
| ·化学法合成肝素/HS的研究 | 第19页 |
| ·酶学方法合成肝素/HS的研究 | 第19-20页 |
| ·低分子肝素的研究 | 第20-21页 |
| ·详细的技术和方法 | 第21-25页 |
| ·肝素前体heparosan的纯化 | 第21页 |
| ·heparosan脱乙酰化修饰 | 第21页 |
| ·化学方法对heparosan进行硫酸化修饰 | 第21-23页 |
| ·浓硫酸法 | 第22页 |
| ·三氧化硫-吡啶法 | 第22页 |
| ·氯磺酸-吡啶法 | 第22-23页 |
| ·氯磺酸-甲酰胺法 | 第23页 |
| ·三乙胺-三氧化硫法 | 第23页 |
| ·酶学方法对heparosan进行硫酸化修饰 | 第23-25页 |
| ·N-脱乙酰N-硫酸化转移酶(NDST) | 第24页 |
| ·O-硫酸转移酶 | 第24-25页 |
| ·heparosan硫酸衍生物的鉴定 | 第25-26页 |
| ·实验研究背景及意义 | 第26页 |
| ·研究内容及创新点 | 第26-27页 |
| ·研究内容 | 第26-27页 |
| ·创新点 | 第27页 |
| 参考文献 | 第27-32页 |
| 第二章 大肠杆菌K5合成heparosan关键酶基因kfiD的克隆 | 第32-49页 |
| ·引言 | 第32-33页 |
| ·实验材料 | 第33-36页 |
| ·菌种和质粒 | 第33-34页 |
| ·培养基 | 第34页 |
| ·生物化学试剂,酶及试剂盒 | 第34-35页 |
| ·实验仪器 | 第35-36页 |
| ·PCR引物 | 第36页 |
| ·实验方法 | 第36-42页 |
| ·大肠杆菌K5基因组DNA的提取 | 第36-37页 |
| ·大肠杆菌K5中kfiD基因全长PCR扩增 | 第37-38页 |
| ·PCR产物目的片段的回收 | 第38-39页 |
| ·目的片段与T载体的连接 | 第39页 |
| ·大肠杆菌E. coli DH5α感受态的制备 | 第39-40页 |
| ·目的基因的转化 | 第40页 |
| ·蓝白斑筛选阳性克隆 | 第40页 |
| ·重组质粒DNA的提取 | 第40-41页 |
| ·重组质粒PCR鉴定 | 第41-42页 |
| ·目的片段的测序及序列分析 | 第42页 |
| ·实验结果与分析 | 第42-47页 |
| ·kfiD基因的PCR扩增 | 第42-43页 |
| ·kfiD的克隆 | 第43-44页 |
| ·kfiD基因的序列分析 | 第44-47页 |
| ·小结 | 第47页 |
| 参考文献 | 第47-49页 |
| 第三章 大肠杆菌K5合成heparosan关键酶基因kfiD的表达 | 第49-63页 |
| ·引言 | 第49-50页 |
| ·实验材料 | 第50-52页 |
| ·菌种和质粒 | 第50页 |
| ·培养基 | 第50页 |
| ·生物化学试剂,酶及试剂盒 | 第50-52页 |
| ·实验仪器 | 第52页 |
| ·实验方法 | 第52-56页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第52页 |
| ·PCR扩增 | 第52-53页 |
| ·双酶切反应 | 第53页 |
| ·酶切产物的回收 | 第53页 |
| ·pET28b-kfiD的构建 | 第53-54页 |
| ·大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态的制备 | 第54页 |
| ·目的基因的转化 | 第54页 |
| ·阳性克隆的筛选与鉴定 | 第54页 |
| ·目的片段的测序 | 第54-55页 |
| ·kfiD在E. coli BL21中的诱导表达 | 第55-56页 |
| ·不同IPTG诱导浓度对外源基因表达的影响 | 第55页 |
| ·不同诱导时间对外源基因表达的影响 | 第55页 |
| ·SDS-PAGE蛋白电泳 | 第55-56页 |
| ·实验结果与分析 | 第56-61页 |
| ·重组载体pET-28b(+)-kfiD的构建 | 第56页 |
| ·重组载体pET-28b(+)-kfiD的PCR鉴定和酶切鉴定 | 第56-58页 |
| ·kfiD基因的诱导表达的SDS-PAGE检测 | 第58-61页 |
| ·不同IPTG诱导浓度对蛋白表达的影响 | 第59-60页 |
| ·不同诱导时间对蛋白表达的影响 | 第60-61页 |
| ·小结 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-63页 |
| 第四章 heparosan的硫酸化衍生物的制备与分析 | 第63-78页 |
| ·引言 | 第63-64页 |
| ·实验材料、试剂 | 第64-65页 |
| ·菌株 | 第64页 |
| ·试剂 | 第64页 |
| ·实验仪器 | 第64-65页 |
| ·实验方法 | 第65-68页 |
| ·heparosan的提取 | 第65页 |
| ·DEAE琼脂糖凝胶Fast Flow纯化 | 第65-66页 |
| ·heparosan硫酸化衍生物的制备 | 第66-67页 |
| ·浓硫酸法制备heparosan硫酸化衍生物 | 第66页 |
| ·氯磺酸-甲酰胺法制备heparosan硫酸化衍生物 | 第66-67页 |
| ·硫酸基含量的测定 | 第67-68页 |
| ·氯化钡-明胶比浊法 | 第67页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第67页 |
| ·硫酸基取代度的计算 | 第67页 |
| ·纯化后heparosan核磁共振分析 | 第67-68页 |
| ·heparosan硫酸化衍生物核磁共振分析 | 第68页 |
| ·肝素钠核磁共振分析 | 第68页 |
| ·结果和分析 | 第68-75页 |
| ·heparosan的纯化 | 第68-69页 |
| ·硫酸根标准曲线的绘制 | 第69页 |
| ·稳定性试验 | 第69-70页 |
| ·heparosan硫酸化衍生物的硫酸基测定 | 第70-71页 |
| ·肝素钠硫酸基取代度的测定 | 第71页 |
| ·纯化后Heparosan的~1H-NMR分析 | 第71-73页 |
| ·Heparosan硫酸化衍生物的~1H-NMR分析 | 第73-75页 |
| ·Heparosan硫酸化衍生物与肝素钠核磁分析比较 | 第75页 |
| ·小结 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-78页 |
| 第五章 结论与展望 | 第78-80页 |
| ·结论 | 第78-79页 |
| ·展望 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文情况 | 第81页 |
