| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 目录 | 第7-12页 |
| 第一章 综述 | 第12-31页 |
| ·肝素及肝素前体 | 第12-13页 |
| ·E.coli K5 Group 2基因簇及相关酶 | 第13-15页 |
| ·E.coli K5 Group 2基因簇 | 第13-14页 |
| ·E.coli K5荚膜合成的相关酶 | 第14-15页 |
| ·E.coli K5 Group 2荚膜多糖的合成研究 | 第15-17页 |
| ·肝素酶 | 第17-21页 |
| ·常见的微生物来源肝素酶 | 第18-19页 |
| ·肝素酶Ⅱ(Heparinase Ⅱ) | 第19-21页 |
| ·肝素酶的应用 | 第21页 |
| ·生产低分子量肝素 | 第21页 |
| ·清除血液中残存肝素 | 第21页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第21-23页 |
| ·大肠杆菌表达系统的表达载体 | 第22页 |
| ·大肠杆菌表达系统的表达方式 | 第22-23页 |
| ·pET·载体表达系统 | 第23页 |
| ·本课题研究内容与创新点 | 第23-25页 |
| ·本课题研究内容 | 第23-24页 |
| ·本课题创新点 | 第24-25页 |
| 参考文献 | 第25-31页 |
| 第二章 Heparosan生物合成关键酶基因kfiA的克隆及序列分析 | 第31-43页 |
| ·前言 | 第31页 |
| ·实验材料 | 第31-35页 |
| ·菌种和质粒 | 第31-32页 |
| ·培养基及缓冲液 | 第32-33页 |
| ·试剂及工具酶 | 第33-34页 |
| ·实验仪器 | 第34-35页 |
| ·实验方法 | 第35-39页 |
| ·大肠杆菌K5基因组DNA的提取 | 第35-36页 |
| ·Heparosan生物合成关键酶基因kfiA的PCR扩增 | 第36页 |
| ·电泳检测PCR产物 | 第36页 |
| ·Heparosan生物合成关键酶基因kfiA的克隆 | 第36-37页 |
| ·E. coli DH5α感受态的制备 | 第37-38页 |
| ·目的基因的转化 | 第38页 |
| ·蓝白斑筛选阳性单菌落 | 第38页 |
| ·菌落PCR验证及送样测序 | 第38-39页 |
| ·结果与讨论 | 第39-41页 |
| ·基因组DNA的提取及PCR扩增 | 第39页 |
| ·Heparosan生物合成关键酶基因kfiA的克隆 | 第39-40页 |
| ·测序结果与序列分析 | 第40-41页 |
| ·小结 | 第41页 |
| 参考文献 | 第41-43页 |
| 第三章 Heparosan生物合成关键酶基因kfiA的表达 | 第43-63页 |
| ·前言 | 第43页 |
| ·实验材料 | 第43-47页 |
| ·菌种和质粒 | 第43-45页 |
| ·培养基与缓冲液 | 第45-46页 |
| ·试剂及工具酶 | 第46-47页 |
| ·实验仪器 | 第47页 |
| ·实验方法 | 第47-53页 |
| ·重组质粒pMD19-kfiA的提取 | 第47-48页 |
| ·kfiA基因片段的扩增 | 第48页 |
| ·重组质粒的酶切 | 第48-49页 |
| ·重组表达载体pET28b-kfiA的构建 | 第49页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第49-50页 |
| ·重组菌E coli BL21(DE3)/pET28b-kfiA的诱导表达 | 第50页 |
| ·表达产物SDS-PAGE分析 | 第50-51页 |
| ·诱导剂用量对蛋白表达的影响 | 第51页 |
| ·诱导温度对蛋白表达的影响 | 第51页 |
| ·诱导时间对蛋白表达的影响 | 第51页 |
| ·包涵体蛋白的制备 | 第51-52页 |
| ·变性条件Ni-NTA亲和层析 | 第52页 |
| ·蛋白质条带分析 | 第52-53页 |
| ·结果与讨论 | 第53-61页 |
| ·表达载体pET28b-kfiA的构建 | 第53-54页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定 | 第54-55页 |
| ·SDS-PAGE检测重组菌的表达 | 第55-56页 |
| ·重组蛋白诱导条件的优化 | 第56-59页 |
| ·诱导剂用量对蛋白表达的影响 | 第56-57页 |
| ·诱导温度对蛋白表达的影响 | 第57-58页 |
| ·诱导时间对蛋白表达的影响 | 第58-59页 |
| ·重组蛋白的变性条件Ni-NTA亲和层析 | 第59-61页 |
| ·小结 | 第61页 |
| 参考文献 | 第61-63页 |
| 第四章 Heparosan生物合成关键酶基因kfiA和kfiC共表达 | 第63-74页 |
| ·前言 | 第63页 |
| ·实验材料 | 第63-65页 |
| ·菌种和质粒 | 第63-64页 |
| ·培养基和缓冲液 | 第64页 |
| ·试剂与工具酶 | 第64页 |
| ·实验仪器 | 第64-65页 |
| ·实验方法 | 第65-66页 |
| ·重组质粒pET28b-kfiA的提取 | 第65页 |
| ·kfiC基因片段的扩增 | 第65页 |
| ·双酶切反应 | 第65-66页 |
| ·共表达载体pET28b-kfiA-C的构建 | 第66页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第66页 |
| ·诱导表达及表达产物检测 | 第66页 |
| ·结果与讨论 | 第66-72页 |
| ·共表达载体pET28b-kfiA-C的构建 | 第66-67页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定 | 第67-68页 |
| ·测序及序列分析 | 第68-71页 |
| ·表达情况分析 | 第71-72页 |
| ·小结 | 第72页 |
| 参考文献 | 第72-74页 |
| 第五章 HeparinaseⅡ的表达、纯化及应用 | 第74-94页 |
| ·前言 | 第74-75页 |
| ·实验材料 | 第75-78页 |
| ·菌种和质粒 | 第75页 |
| ·培养基及缓冲液 | 第75-76页 |
| ·试剂与工具酶 | 第76-77页 |
| ·实验仪器 | 第77-78页 |
| ·实验方法 | 第78-84页 |
| ·Heparinase Ⅱ重组菌的诱导表达 | 第78-79页 |
| ·Ni-NTA亲和层析纯化Heparinase Ⅱ | 第79页 |
| ·蛋白含量测定 | 第79-80页 |
| ·Heparinase Ⅱ酶活的测定 | 第80-81页 |
| ·Heparinase Ⅱ的应用 | 第81-84页 |
| ·Heparosan的裂解 | 第81-82页 |
| ·菌体荚膜的原位处理 | 第82-83页 |
| ·荚膜处理后转化及转化后的表达 | 第83-84页 |
| ·结果与讨论 | 第84-91页 |
| ·HeparinaseⅡ重组菌的表达 | 第84-85页 |
| ·Ni-NTA亲和层析 | 第85-86页 |
| ·蛋白质标准曲线 | 第86页 |
| ·Ni-NTA亲和层析纯化Heparinase Ⅱ | 第86-87页 |
| ·HoparinaseⅡ的应用 | 第87-91页 |
| ·Heparosan的裂解 | 第87-88页 |
| ·原位处理K5荚膜 | 第88-89页 |
| ·K5转化及转化后表达 | 第89-91页 |
| ·小结 | 第91页 |
| 参考文献 | 第91-94页 |
| 第六章 结论与展望 | 第94-96页 |
| ·结论 | 第94-95页 |
| ·展望 | 第95-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第97页 |
