| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 目录 | 第7-11页 |
| 1 前言 | 第11-23页 |
| ·研究背景 | 第11-16页 |
| ·1,3-丙二醇的应用 | 第11页 |
| ·微生物发酵法生产1,3-丙二醇 | 第11-12页 |
| ·甘油的代谢途径 | 第12-15页 |
| ·编码DHAK基因的结构和功能 | 第15-16页 |
| ·K. pneumoniae基因转化方法 | 第16-18页 |
| ·化学转化 | 第16页 |
| ·电转化 | 第16-18页 |
| ·编码荚膜多糖基因的结构分析 | 第18-20页 |
| ·K. pneumoniae遗传改造方法 | 第20-22页 |
| ·物理和化学因素的诱导突变 | 第20页 |
| ·转座子插入突变 | 第20页 |
| ·同源重组技术 | 第20-22页 |
| ·选题目的及意义 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-34页 |
| ·实验材料 | 第23-26页 |
| ·主要实验仪器 | 第23-24页 |
| ·实验用酶和试剂 | 第24页 |
| ·实验用质粒与菌株 | 第24-25页 |
| ·实验用的培养基 | 第25-26页 |
| ·实验方法 | 第26-34页 |
| ·细菌总DNA的提取 | 第26页 |
| ·引物的设计和PCR扩增 | 第26-27页 |
| ·PCR产物的回收,加“A”以及与T载体的连接 | 第27页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第27页 |
| ·DNA序列的平末端化 | 第27页 |
| ·酶切DNA片段与质粒载体连接 | 第27页 |
| ·大肠杆菌热击转化感受态细胞的制作及转化方法 | 第27-28页 |
| ·K. pneumoniae电转感受态细胞的制作及电转化方法 | 第28页 |
| ·抗性标记的消除 | 第28-29页 |
| ·质粒pDK6-red和pDK6-flp的消除 | 第29页 |
| ·K.pneumoniaeTUAC01及改造菌株培养条件 | 第29页 |
| ·细胞提取液的制备方法 | 第29页 |
| ·蛋白质含量的测定方法 | 第29-30页 |
| ·1,3-丙二醇氧化还原酶活性测定方法 | 第30-31页 |
| ·甘油脱氢酶活性的测定方法 | 第31页 |
| ·DHAK酶活性的测定方法 | 第31-32页 |
| ·高效液相色谱分析方法 | 第32-34页 |
| 3 结果与讨论 | 第34-68页 |
| ·K.pneumoniae TUAC01表达DHAK的基因克隆 | 第34-38页 |
| ·dhak3部分基因的克隆 | 第35页 |
| ·dhak3和dhak部分基因的克隆 | 第35-36页 |
| ·dhak1和dhak2基因的克隆 | 第36页 |
| ·dhak部分基因的克隆 | 第36-37页 |
| ·编码DHAK的基因序列分析 | 第37-38页 |
| 小结 | 第38页 |
| ·K. pneumoniae电转化条件的优化 | 第38-42页 |
| ·最适电击电压的确定 | 第39页 |
| ·感受态细胞最适生长状态的确定 | 第39-40页 |
| ·感受态细胞密度的确定 | 第40页 |
| ·EDTA最适浓度的确定 | 第40-41页 |
| ·质粒DNA浓度对转化效率的影响 | 第41-42页 |
| 小结 | 第42页 |
| ·K. pneumoniae基因重组系统工具质粒的构建 | 第42-51页 |
| ·构建表达Red重组酶的质粒pDK6-red | 第44-46页 |
| ·构建表达FLP重组酶的质粒pDK6-flp | 第46-49页 |
| ·构建质粒pDK6s-flp | 第49-51页 |
| 小结 | 第51页 |
| ·编码DHAKI和DHAKII基因功能的研究 | 第51-68页 |
| ·构建敲除dhak基因的突变株 | 第53-55页 |
| ·构建敲除dhak1基因的突变株 | 第55-57页 |
| ·构建敲除dhak2基因的突变株 | 第57-60页 |
| ·构建敲除dhak3基因的突变株 | 第60-61页 |
| ·构建敲除dhak1和dhak2基因的突变株 | 第61-63页 |
| ·构建敲除dhak1,dhak2,dhak3和dhak基因的突变株 | 第63-64页 |
| ·IPTG浓度对Red重组效率的影响 | 第64-65页 |
| ·IPTG浓度对FLP重组效率的影响 | 第65页 |
| ·突变株GDH、PDOR、DHAKII酶活的测定 | 第65-66页 |
| ·突变株代谢产物含量变化的分析 | 第66-67页 |
| 小结 | 第67-68页 |
| 4 结论 | 第68-69页 |
| 5 展望 | 第69-70页 |
| 6 参考文献 | 第70-77页 |
| 7 论文发表和专利申请情况 | 第77-78页 |
| 8 致谢 | 第78-79页 |
| 附表一 K.pneumoniae TUAC01编码DHAK的基因序列 | 第79-81页 |
