| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 缩略语 | 第8-9页 |
| 目录 | 第9-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-22页 |
| 1 miRNA 概述 | 第14-18页 |
| ·miRNA 的发现 | 第14页 |
| ·miRNA 的合成及其作用机理 | 第14-16页 |
| ·miRNA 的生物合成过程 | 第14-16页 |
| ·miRNA 的作用机理 | 第16页 |
| ·miRNA 的特征、功能和意义 | 第16-18页 |
| ·miRNA 的特征 | 第16-17页 |
| ·miRNA 的功能和意义 | 第17-18页 |
| 2 miRNA 的鉴定及表达的检测 | 第18-19页 |
| ·miRNA 的鉴定方法 | 第18页 |
| ·直接克隆法鉴定 miRNA | 第18页 |
| ·嵌合基因芯片法鉴定 miRNA | 第18页 |
| ·生物信息学方法识别 miRNA | 第18页 |
| ·miRNA 表达的检测 | 第18-19页 |
| 3 miRNA 的靶基因的寻找与鉴定 | 第19-22页 |
| ·miRNA 靶基因的寻找方法 | 第19-20页 |
| ·生物信息学方法 | 第19-20页 |
| ·生物学实验方法 | 第20页 |
| ·miRNA 靶基因的鉴定 | 第20-22页 |
| 第二章 实验设计方案 | 第22-25页 |
| 1 实验的目的和意义 | 第22页 |
| 2 实验内容 | 第22-24页 |
| 3 实验流程图 | 第24-25页 |
| 第三章 家蚕 BmN 细胞中 miRNA 的检测 | 第25-31页 |
| 1 实验材料与试剂 | 第25页 |
| ·材料 | 第25页 |
| ·试剂 | 第25页 |
| ·试剂配制 | 第25页 |
| 2 miRNA 基因芯片检测 | 第25-27页 |
| ·Trizol 法提取家蚕 BmN 细胞总 RNA | 第26页 |
| ·芯片实验基本过程 | 第26-27页 |
| ·分离小 RNA | 第26页 |
| ·加 polyA 尾与核苷酸标记 | 第26页 |
| ·杂交 | 第26页 |
| ·检测及图像分析 | 第26-27页 |
| 3 结果 | 第27-30页 |
| 4 讨论 | 第30-31页 |
| 第四章 家蚕 miRNA表达载体的构建 | 第31-46页 |
| 1 材料与试剂 | 第31-33页 |
| ·材料 | 第31页 |
| ·试剂 | 第31页 |
| ·主要试剂的配制 | 第31-33页 |
| 2 方法 | 第33-40页 |
| ·家蚕基因组 DNA 提取 | 第33页 |
| ·家蚕基因组 DNA 的提取步骤 | 第33页 |
| ·家蚕基因组 DNA 的检测 | 第33页 |
| ·重组质粒 pIEx-1-EGFP 的构建 | 第33-37页 |
| ·EGFP 基因的 PCR 扩增 | 第33-34页 |
| ·EGFP 基因与 pIEx-1 载体的双酶切 | 第34-35页 |
| ·连接反应 | 第35页 |
| ·CaCl2 法制备 E.coliTG1 感受态细胞 | 第35页 |
| ·连接产物的转化 | 第35-36页 |
| ·重组质粒提取 | 第36页 |
| ·重组质粒的 PCR 及双酶切鉴定 | 第36-37页 |
| ·重组质粒的测序鉴定 | 第37页 |
| ·重组质粒 pIEx-1-EGFP-pri-mir-1a/8/14/133 的构建 | 第37-40页 |
| ·pri-mir-1a/8/14/133 基因的 PCR 扩增 | 第37-38页 |
| ·pri-mir-1a/8/14/133 基因扩增产物和 pIEx-1-EGFP 载体的双酶切并纯化 | 第38-39页 |
| ·连接反应 | 第39页 |
| ·连接产物的转化 | 第39页 |
| ·重组质粒的提取与鉴定 | 第39-40页 |
| ·重组质粒的测序鉴定 | 第40页 |
| 3 结果 | 第40-44页 |
| ·电泳和紫外分光光度法检测家蚕基因组 DNA | 第40-41页 |
| ·PCR 扩增 EGFP 基因 | 第41页 |
| ·重组质粒 pIEx-1-EGFP 的鉴定 | 第41-42页 |
| ·PCR 扩增 pri-mir-1a/8/14/133 | 第42-43页 |
| ·重组质粒 pIEx-1-EGFP-pri-mir-1a/8/14/133 的鉴定 | 第43-44页 |
| 4 讨论 | 第44-46页 |
| 第五章 家蚕 miRNA的过表达及检测 | 第46-66页 |
| 1 材料与试剂 | 第46-48页 |
| ·试剂及仪器 | 第46页 |
| ·试剂配方 | 第46-48页 |
| 2 方法 | 第48-56页 |
| ·细胞培养与冻存、复苏 | 第48-49页 |
| ·家蚕 BmN 细胞贴壁培养 | 第48-49页 |
| ·细胞冻存 | 第49页 |
| ·细胞复苏 | 第49页 |
| ·家蚕 BmN 细胞中重组质粒的脂质粒介导法转染 | 第49-50页 |
| ·家蚕 BmN 细胞中化学合成的 miRNA mimics 转染 | 第50页 |
| ·家蚕 BmN 细胞小 RNA 的提取 | 第50-51页 |
| ·Stem-loop RT-PCR 法检测细胞中 miRNA 的表达水平 | 第51-54页 |
| ·逆转录反应 | 第52-53页 |
| ·荧光定量 PCR 反应 | 第53页 |
| ·荧光定量 PCR 结果分析 | 第53-54页 |
| ·Northern blot 法检测细胞中 miRNA 的表达水平 | 第54-56页 |
| ·探针及凝胶的制备 | 第54-55页 |
| ·地高辛标记的探针的制备 | 第54页 |
| ·凝胶的制备 | 第54-55页 |
| ·样品制备 | 第55页 |
| ·上样 | 第55页 |
| ·转膜 | 第55页 |
| ·紫外交联 | 第55页 |
| ·预杂交 | 第55-56页 |
| ·杂交 | 第56页 |
| ·洗膜 | 第56页 |
| ·DIG Luminescent Detection Kit 检测 | 第56页 |
| 3. 结果 | 第56-64页 |
| ·重组质粒转染家蚕 BmN 细胞的效率 | 第56-57页 |
| ·miRNA mimics 转染家蚕 BmN 细胞的效率 | 第57-58页 |
| ·Stem-loop RT-PCR 检测 miRNA 的过表达水平 | 第58-63页 |
| ·重组质粒转染家蚕细胞后 miRNA 的过表达情况 | 第58-61页 |
| ·qRT-PCR 反应的扩增曲线和溶解曲线分析 | 第59-60页 |
| ·bmo-miR-1a/8/14/133 过表达差异分析 | 第60-61页 |
| ·miRNA mimics 转染家蚕细胞后 miRNA 的过表达情况 | 第61-63页 |
| ·qRT-PCR 反应的扩增曲线和溶解曲线分析 | 第61-62页 |
| ·bmo-miR-1a/8/14 上调差异分析 | 第62-63页 |
| ·miRNA 的 Northern blot 检测 | 第63-64页 |
| 4 讨论 | 第64-66页 |
| 第六章 bmo-miR-14 对 BmN 细胞中基因的 mRNA 及蛋白表达水平的影响 | 第66-83页 |
| 1 材料与试剂 | 第66-69页 |
| ·仪器及试剂 | 第66页 |
| ·试剂配制 | 第66-69页 |
| ·双向电泳试剂配制 | 第66-68页 |
| ·考马斯亮兰染色试剂配制 | 第68页 |
| ·质谱鉴定用试剂 | 第68-69页 |
| 2 方法 | 第69-76页 |
| ·表达谱芯片检测 bmo-miR-14 上调对家蚕 BmN 细胞中基因 mRNA 水平的影响 | 第69-71页 |
| ·实验样品的准备 | 第69页 |
| ·芯片实验基本过程 | 第69-70页 |
| ·家蚕 BmN 细胞总 RNA 的提取 | 第69-70页 |
| ·对样品 RNA 进行荧光标记 | 第70页 |
| ·杂交与清洗 | 第70页 |
| ·芯片扫描与图像的采集、数据分析 | 第70-71页 |
| ·双向电泳及质谱分析 bmo-miR-14 对家蚕 BmN 细胞中基因蛋白水平的影响 | 第71-75页 |
| ·样品制备 | 第71-72页 |
| ·miRNA mimics 转染的家蚕 BmN 细胞总蛋白提取 | 第71-72页 |
| ·Bradford 法蛋白定量 | 第72页 |
| ·双向电泳 | 第72-74页 |
| ·双向电泳第一向：等电聚焦电泳 | 第72-73页 |
| ·平衡胶条 | 第73页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第73-74页 |
| ·双向电泳凝胶考马斯亮兰染色 | 第74页 |
| ·凝胶扫描及蛋白差异分析 | 第74页 |
| ·质谱鉴定 | 第74-75页 |
| ·胶内酶解 | 第74-75页 |
| ·点靶 | 第75页 |
| ·MALDI-TOF/TOF 质谱鉴定和数据库搜索 | 第75页 |
| ·搜索结果的判定标准 | 第75页 |
| ·bmo-miR-14 潜在靶基因靶位点的预测 | 第75-76页 |
| 3 结果 | 第76-81页 |
| ·RNA 的纯度及浓度检测 | 第76页 |
| ·转染 bmo-miR-14 mimics 的家蚕 BmN 细胞的表达谱芯片分析 | 第76-77页 |
| ·Bradford 法蛋白定量 | 第77-78页 |
| ·双向电泳图谱分析 | 第78页 |
| ·差异蛋白的质谱鉴定 | 第78-79页 |
| ·bmo-miR-14 潜在靶基因靶位点的预测 | 第79-81页 |
| 4 讨论 | 第81-83页 |
| 第七章 bmo-miR-133对 B mN 细胞中基因的 mRNA及蛋白表达水平的影响 | 第83-90页 |
| 1 材料与试剂 | 第83页 |
| 2 方法 | 第83-84页 |
| ·表达谱芯片检测 bmo-miR-133 对家蚕 BmN 细胞中基因 mRNA 水平的影响 | 第83页 |
| ·实验样品的准备 | 第83页 |
| ·芯片实验基本过程、扫描与图像的采集、数据分析 | 第83页 |
| ·双向电泳及质谱分析 bmo-miR-133 对家蚕 BmN 细胞中基因蛋白水平的影响 | 第83-84页 |
| ·样品制备 | 第83-84页 |
| ·转染重组质粒至家蚕 BmN 细胞及细胞总蛋白提取 | 第83-84页 |
| ·Bradford 法蛋白定量 | 第84页 |
| ·双向电泳 | 第84页 |
| ·双向电泳凝胶考马斯亮兰染色 | 第84页 |
| ·凝胶扫描及蛋白差异分析 | 第84页 |
| ·质谱鉴定 | 第84页 |
| ·bmo-miR-133 靶位点的分析 | 第84页 |
| 3 结果 | 第84-89页 |
| ·RNA 的浓度及纯度检测 | 第84-85页 |
| ·过表达 bmo-miR-133 的家蚕 BmN 细胞的表达谱芯片分析 | 第85-86页 |
| ·Bradford 法蛋白定量 | 第86-87页 |
| ·双向电泳图谱分析 | 第87页 |
| ·差异蛋白的质谱鉴定 | 第87-88页 |
| ·bmo-miR-133 潜在靶基因靶位点的预测 | 第88-89页 |
| 4 结论 | 第89-90页 |
| 结论 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-95页 |
| 致谢 | 第95页 |
