| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 缩略词表 | 第10-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-16页 |
| 1. 5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA) | 第11-16页 |
| ·ALA简介 | 第11-12页 |
| ·ALA的合成 | 第11-12页 |
| ·ALA C5合成途径的调控 | 第12页 |
| ·血红素 | 第12-14页 |
| ·血红素的生物功能 | 第12-13页 |
| ·血红素的生物合成途径与代谢 | 第13-14页 |
| ·大肠杆菌氨基酸转运体系 | 第14-15页 |
| ·大肠杆菌氨基酸的转运 | 第14页 |
| ·知的大肠杆菌ALA转运系统 | 第14-15页 |
| ·HemB的抑制因子YicL | 第15页 |
| ·SsrA(tmRNA)蛋白降解标签 | 第15页 |
| ·转录组学分析技术 | 第15-16页 |
| 第二章 ALA产量提高的多点尝试 | 第16-40页 |
| 1. 引言 | 第16-17页 |
| 2. 实验材料 | 第17-21页 |
| ·菌株与质粒 | 第17-18页 |
| ·引物 | 第18-19页 |
| ·生化试剂及试剂盒 | 第19-20页 |
| ·仪器与设备 | 第20页 |
| ·培养基及组成 | 第20-21页 |
| 3. 实验方法 | 第21-30页 |
| ·构建表达rhtA和yeaS的质粒 | 第21-25页 |
| ·引物设计 | 第21页 |
| ·大肠杆菌基因组的提取 | 第21页 |
| ·扩增rhtA和yeaS基因 | 第21-22页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第22页 |
| ·pCL1920载体质粒的提取 | 第22页 |
| ·限制酶切目的基因和质粒载体 | 第22-23页 |
| ·体外连接目的基因和质粒载体 | 第23页 |
| ·大肠杆菌化学感受态的制备 | 第23页 |
| ·大肠杆菌的化学转化 | 第23-24页 |
| ·重组子的筛选与鉴定 | 第24-25页 |
| ·mppA及dppA基因的敲除 | 第25-26页 |
| ·敲除引物的设计与基因敲除片段的扩增 | 第25页 |
| ·大肠杆菌基因敲除感受态的制备 | 第25页 |
| ·大肠杆菌电转化基因敲除 | 第25页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第25-26页 |
| ·pDK46质粒与筛选抗性基因的消除 | 第26页 |
| ·构建过表达yicL的质粒菌株与质粒 | 第26-27页 |
| ·构建表达hmuO_(c.g)的大肠杆菌菌株 | 第27页 |
| ·HemB蛋白弱化菌株的构建 | 第27-29页 |
| ·构建HemB蛋白弱化的菌株 | 第27-28页 |
| ·敲除sspB基因 | 第28-29页 |
| ·菌株的构建与保存 | 第29页 |
| ·ALA发酵的控制与产物的检测 | 第29-30页 |
| ·发酵培养控制流程 | 第29页 |
| ·发酵产物的检测 | 第29-30页 |
| 4. 实验结果 | 第30-38页 |
| ·敲除ALA吸收系统不能促进ALA的积累 | 第30-31页 |
| ·RhtA可以分泌ALA,促进ALA生产菌株积累ALA | 第31-32页 |
| ·YeaS不能分泌ALA | 第32-33页 |
| ·YeaS和RhtA的二级结构 | 第33-35页 |
| ·表达HemB抑制因子不能促进ALA的积累 | 第35页 |
| ·表达谷氨酸棒杆菌的血红素氧化酶编码基因不能促进ALA的积累 | 第35-36页 |
| ·大肠杆菌HemB蛋白的弱化引起ALA产量的降低 | 第36-37页 |
| ·sspB基因的敲除可以部分回补HemB蛋白弱化引起的ALA产量的降低 | 第37-38页 |
| ·低拷贝表达hemB基因不能促进ALA的积累 | 第38页 |
| 5. 讨论与总结 | 第38-40页 |
| 第三章 C5途径加强对大肠杆菌及谷氨酸棒杆菌部分主要代谢产物的影响 | 第40-53页 |
| 1. 引言 | 第40页 |
| 2. 实验材料 | 第40-42页 |
| ·引物 | 第41页 |
| ·培养基 | 第41-42页 |
| 3. 实验方法 | 第42-46页 |
| ·相关代谢产物的分析方法 | 第42-44页 |
| ·乙酸,丙酮酸等有机酸的分析 | 第42页 |
| ·谷氨酸的分析 | 第42页 |
| ·血红素的测定方法 | 第42-44页 |
| ·构建表达粘质沙雷氏菌血红素外膜受体蛋白的质粒 | 第44-45页 |
| ·谷氨酸棒杆菌感受态制备以及转化 | 第45-46页 |
| ·谷氨酸棒杆菌发酵ALA的实验操作 | 第46页 |
| 4. 结果 | 第46-52页 |
| ·在大肠杆菌中过表达hemA,hemL基因引起乙酸积累,生长及耗糖的变化 | 第46-47页 |
| ·大肠杆菌中过表达hemA,hemL基因引血红素含量的增多 | 第47-48页 |
| ·在大肠杆菌中过表达hemA,hemL基因引呼吸速率的加快 | 第48页 |
| ·在谷氨酸棒杆菌中过表达hemA,hemL引起谷氨酸的积累 | 第48-50页 |
| ·在谷氨酸棒杆菌表达hemA,hemL引起卟啉类物质的积累 | 第50页 |
| ·外源添加氯高铁血红素引起大肠杆菌乙酸积累的变化 | 第50-51页 |
| ·外源添加ALA与氯高铁血红素不能促进谷氨酸的积累 | 第51-52页 |
| 5. 总结与讨论 | 第52-53页 |
| 第四章 HemB蛋白弱化对菌体全局转录水平的影响 | 第53-79页 |
| 1. 引言 | 第53-55页 |
| 2 实验材料 | 第55-56页 |
| 3 实验方法 | 第56-62页 |
| ·提取大肠杆菌总RNA用于转录组测序分析 | 第56-57页 |
| ·华大基因转录组分析的流程 | 第57-61页 |
| ·大肠杆菌总tRNA的提取方法 | 第61-62页 |
| 4 实验结果 | 第62-77页 |
| ·DAL及DsAL合成ALA能力的体外测定 | 第62-64页 |
| ·转录组学分析结果 | 第64-69页 |
| ·大肠杆菌HemB弱化前后生长状态,耗糖及产乙酸的差别 | 第69-71页 |
| ·大肠杆菌产谷氨酸能力的差别 | 第71-72页 |
| ·大肠杆菌血红素含量的差别 | 第72页 |
| ·HemB弱化对外源C4途径生产ALA能力的影响 | 第72-73页 |
| ·添加氯高铁血红素对ALA积累的影响 | 第73-74页 |
| ·添加氯高铁血红素对菌体生长及葡萄糖消耗的影响 | 第74-75页 |
| ·添加氯高铁血红素对菌体乙酸积累的影响 | 第75-76页 |
| ·DH5α,DBs,DAL及DsAL呼吸速率的测定 | 第76-77页 |
| 5 讨论与总结 | 第77-79页 |
| 全文总结 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第85-86页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第86页 |
