| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-13页 |
| 绪论 | 第13-15页 |
| 1 文献综述 | 第15-28页 |
| ·鸡大肠杆菌病的发病特点 | 第15-17页 |
| ·鸡大肠杆菌病病因和致病因子 | 第17-24页 |
| ·鸡大肠杆菌病病原 | 第17-18页 |
| ·鸡大肠杆菌病的致病因子 | 第18-24页 |
| ·菌毛蛋白 | 第18-19页 |
| ·毒素的致病作用 | 第19-20页 |
| ·内毒素 | 第20-21页 |
| ·热敏肠毒素（LT）和Vero 毒素 | 第21-22页 |
| ·外膜蛋白（Omp） | 第22-24页 |
| ·铁转运系统 | 第24页 |
| ·C01V 质粒 | 第24页 |
| ·鸡大肠杆菌病的防治 | 第24-28页 |
| ·一般性防治措施 | 第24-25页 |
| ·药物的应用 | 第25-26页 |
| ·一般药物防治 | 第25页 |
| ·中草药防治 | 第25-26页 |
| ·抗病育种 | 第26页 |
| ·研制菌苗免疫 | 第26-28页 |
| ·活菌苗免疫 | 第26页 |
| ·灭活苗免疫 | 第26-27页 |
| ·抗原提取苗免疫 | 第27页 |
| ·基因工程疫苗防治 | 第27-28页 |
| 2 大肠杆菌的分离鉴定、药敏和致病力实验 | 第28-34页 |
| ·材料与方法 | 第28-29页 |
| ·材料 | 第28页 |
| ·病料 | 第28页 |
| ·培养基和试剂 | 第28页 |
| ·供试动物 | 第28页 |
| ·方法 | 第28-29页 |
| ·病原菌的分离和培养 | 第28页 |
| ·病原菌的鉴定 | 第28-29页 |
| ·细菌形态观察 | 第28-29页 |
| ·三糖铁琼脂生化试验 | 第29页 |
| ·微量生化试验 | 第29页 |
| ·血清型鉴定试验 | 第29页 |
| ·致病力试验 | 第29页 |
| ·药物敏感试验 | 第29页 |
| ·结果与分析 | 第29-33页 |
| ·病原菌的分离结果 | 第29-30页 |
| ·病原菌的鉴定结果 | 第30-32页 |
| ·细菌镜检结果 | 第30-31页 |
| ·克氏三糖铁生化试验结果 | 第31页 |
| ·微量生化试验鉴定结果 | 第31-32页 |
| ·血清型鉴定结果 | 第32页 |
| ·药敏试验结果 | 第32页 |
| ·致病力实验结果 | 第32-33页 |
| ·小结 | 第33-34页 |
| 3 鸡致病性大肠杆菌多价灭活苗的研制 | 第34-39页 |
| ·材料与方法 | 第34-36页 |
| ·材料 | 第34页 |
| ·菌种 | 第34页 |
| ·培养基和试剂 | 第34页 |
| ·供试动物 | 第34页 |
| ·方法 | 第34-36页 |
| ·动物接种试验 | 第34页 |
| ·肠毒素鉴定 | 第34页 |
| ·制备攻毒菌液 | 第34-35页 |
| ·鸡大肠杆菌灭活苗的制备与检验 | 第35-36页 |
| ·菌种增殖 | 第35页 |
| ·纯粹检验 | 第35页 |
| ·活菌计数 | 第35页 |
| ·菌悬液的制备 | 第35页 |
| ·灭活 | 第35页 |
| ·无菌检验 | 第35页 |
| ·菌苗制备 | 第35页 |
| ·安全检验 | 第35-36页 |
| ·效力试验 | 第36页 |
| ·保存期试验 | 第36页 |
| ·结果与分析 | 第36-38页 |
| ·动物接种试验 | 第36页 |
| ·肠毒素鉴定 | 第36页 |
| ·纯粹检验和活菌计数 | 第36页 |
| ·鸡大肠杆菌灭活苗的实验室检验 | 第36-38页 |
| ·无菌检验 | 第36页 |
| ·安全检验 | 第36页 |
| ·稳定性测定 | 第36-37页 |
| ·免疫剂量 | 第37页 |
| ·效力检验 | 第37页 |
| ·免疫期试验 | 第37-38页 |
| ·保存期试验 | 第38页 |
| ·小结 | 第38-39页 |
| 4 鸡大肠杆菌I 型菌毛PILA 基因和外膜蛋白C 基因的克隆和序列分析 | 第39-54页 |
| ·材料和方法 | 第39-42页 |
| ·材料 | 第39页 |
| ·菌株与质粒 | 第39页 |
| ·酶和试剂 | 第39页 |
| ·方法 | 第39-42页 |
| ·引物的设计与合成 | 第39-40页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第40页 |
| ·I 型菌毛pilA 基因和外膜蛋白C 基因PCR 产物的回收 | 第40页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第40-41页 |
| ·I 型菌毛pilA 基因和外膜蛋白C 基因PCR 产物的连接反应 | 第41页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第41页 |
| ·质粒的小量制备 | 第41-42页 |
| ·重组子的筛选和酶切鉴定 | 第42页 |
| ·质粒DNA 的定量技术 | 第42页 |
| ·I 型菌毛基因和外膜蛋白基因的序列测定与同源性分析 | 第42页 |
| ·结果与分析 | 第42-53页 |
| ·I 型菌毛pilA 基因的克隆及测序结果 | 第42-46页 |
| ·I 型菌毛pilA 基因的PCR 扩增结果 | 第42-43页 |
| ·I 型菌毛pilA 基因重组质粒的酶切鉴定 | 第43页 |
| ·阳性重组子所含I 型菌毛基因的序列测定与同源性比较 | 第43-46页 |
| ·外膜蛋白C 基因的克隆及测序结果 | 第46-53页 |
| ·外膜蛋白C 基因的PCR 扩增结果 | 第46-47页 |
| ·外膜蛋白C 基因重组质粒的酶切鉴定 | 第47页 |
| ·阳性重组子所含外膜蛋白C 基因的序列测定与同源性比较 | 第47-53页 |
| ·小结 | 第53-54页 |
| 5 鸡大肠杆菌I 型菌毛PILA 基因和外膜蛋白C 基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 | 第54-61页 |
| ·材料与方法 | 第54-57页 |
| ·材料 | 第54-55页 |
| ·菌株与质粒 | 第54-55页 |
| ·酶和试剂 | 第55页 |
| ·方法 | 第55-57页 |
| ·含目的基因的重组质粒pUCmT-pilA，pUCmT-OmpC 及表达载体质粒pET-28a 的提取与纯化（方法同前） | 第55页 |
| ·目的片段及表达载体质粒的酶切 | 第55页 |
| ·酶切后目的片段及载体的回收，连接和转化 | 第55页 |
| ·阳性重组子的筛选和鉴定（方法同前） | 第55页 |
| ·二价基因工程菌株的构建 | 第55-56页 |
| ·重组菌株的诱导表达 | 第56页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE 检测 | 第56页 |
| ·表达产物在大肠杆菌细胞中的分布 | 第56-57页 |
| ·表达产物的Western blot 分析 | 第57页 |
| ·结果与分析 | 第57-60页 |
| ·鸡大肠杆菌 O_1I 型菌毛 pilA 基因重组质粒的酶切鉴定 | 第57页 |
| ·鸡大肠杆菌 O_1外膜蛋白 C 基因重组表达质粒的酶切鉴定 | 第57-58页 |
| ·二价基因工程融合质粒的构建 | 第58页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE 检测 | 第58-59页 |
| ·表达产物在大肠杆菌中的分布 | 第59-60页 |
| ·表达产物的Western blot 检测 | 第60页 |
| ·小结 | 第60-61页 |
| 6 鸡致病性大肠杆菌基因工程菌株诱导条件的优化 | 第61-72页 |
| ·材料和方法 | 第61-63页 |
| ·材料 | 第61页 |
| ·菌株 | 第61页 |
| ·试剂 | 第61页 |
| ·方法 | 第61-63页 |
| ·菌株的活化 | 第61页 |
| ·诱导条件的优化 | 第61-62页 |
| ·温度 | 第61页 |
| ·接菌量 | 第61-62页 |
| ·诱导时机 | 第62页 |
| ·IPTG 浓度 | 第62页 |
| ·诱导时间 | 第62页 |
| ·制蛋白样 | 第62页 |
| ·SDS-PAGE 检测 | 第62页 |
| ·蛋白表达量的测定 | 第62-63页 |
| ·结果 | 第63-71页 |
| ·SDS-PAGE 结果 | 第63-68页 |
| ·蛋白含检测量结果 | 第68-71页 |
| ·小结 | 第71-72页 |
| 7 鸡大肠杆菌病基因工程菌株的保护性实验 | 第72-81页 |
| ·材料与方法 | 第72-77页 |
| ·材料 | 第72-73页 |
| ·实验动物 | 第72页 |
| ·试剂 | 第72页 |
| ·器械 | 第72页 |
| ·载玻片的清洗 | 第72页 |
| ·多聚甲醛固定液的配制 | 第72页 |
| ·苏木精染液的配制 | 第72-73页 |
| ·伊红染液的配制 | 第73页 |
| ·蛋白甘油粘贴剂的配制 | 第73页 |
| ·方法 | 第73-77页 |
| ·疫苗的制备 | 第73页 |
| ·攻毒菌株的复壮 | 第73-74页 |
| ·保护性实验 | 第74页 |
| ·ELISA | 第74页 |
| ·石蜡切片 | 第74-77页 |
| ·组织取材、固定、脱水和石蜡包埋流程 | 第75-76页 |
| ·组织切片、H-E 染色流程 | 第76-77页 |
| ·鸡体效力实验 | 第77页 |
| ·结果与分析 | 第77-80页 |
| ·基因工程菌株安全性实验 | 第77页 |
| ·疫苗的安全性检验 | 第77页 |
| ·间接ELISA 检测小鼠抗血清结果 | 第77-78页 |
| ·基因工程菌株的小鼠免疫保护试验结果 | 第78-79页 |
| ·鸡体免疫实验 | 第79-80页 |
| ·小结 | 第80-81页 |
| 讨论 | 第81-84页 |
| 结论 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-90页 |
| 附录 | 第90-92页 |
| 攻读学位期间取得的科研成果清单 | 第92页 |
