| 本研究创新点 | 第1-6页 |
| 中文摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-14页 |
| 第一章 前言 | 第14-44页 |
| 1. 蛋白酶及蛋白酶的自降解现象 | 第14-33页 |
| ·蛋白酶概述 | 第14-15页 |
| ·丝氨酸蛋白酶概述 | 第15-17页 |
| ·嗜热蛋白酶WF146概述 | 第17-18页 |
| ·蛋白质分子柔韧性 | 第18-19页 |
| ·蛋白质(酶)的稳定性 | 第19-24页 |
| ·比较蛋白质稳定性的方法 | 第24-26页 |
| ·蛋白酶的自加工与自降解 | 第26-29页 |
| ·蛋白酶抗白降解策略 | 第29-31页 |
| ·蛋白酶的底物特异性 | 第31-33页 |
| 2. 蛋白酶的应用 | 第33-37页 |
| ·角蛋白及角蛋白废弃物处理 | 第33-34页 |
| ·朊蛋白及朊蛋白污染处理 | 第34-36页 |
| ·蛋白酶的其它应用 | 第36-37页 |
| 3. 蛋白质(酶)的异源表达 | 第37-41页 |
| ·大肠埃希氏杆菌表达系统 | 第37-38页 |
| ·枯草芽胞杆菌表达系统 | 第38-39页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第39-41页 |
| 4. 真核表达系统的N糖基化修饰 | 第41-43页 |
| 5. 本课题的研究目的、内容和意义 | 第43-44页 |
| 第二章 蛋白酶WF146自降解机制及抗自降解研究 | 第44-90页 |
| 1. 实验材料 | 第44-48页 |
| ·菌株和质粒 | 第44页 |
| ·药品及试剂 | 第44-45页 |
| ·培养基及溶液配制 | 第45-48页 |
| 2. 实验方法 | 第48-60页 |
| ·突变体构建 | 第48-53页 |
| ·野生型及突变体蛋白酶表达 | 第53页 |
| ·蛋白质电泳检测 | 第53-55页 |
| ·蛋白质N末端测序 | 第55页 |
| ·蛋白酶的亲和层析纯化 | 第55-56页 |
| ·凝胶过滤法分离蛋白 | 第56-57页 |
| ·蛋白酶酶活力测定 | 第57页 |
| ·蛋白酶稳定性测定 | 第57-58页 |
| ·戊二醛交联蛋白 | 第58页 |
| ·蛋白酶明胶活性染色 | 第58-59页 |
| ·纯化包含体 | 第59页 |
| ·包含体变性复性 | 第59-60页 |
| 3. 结果与分析 | 第60-79页 |
| ·嗜热蛋白酶WF146的自降解研究 | 第60-68页 |
| ·自降解位点突变体构建、表达及降解程度比较 | 第68-69页 |
| ·野生型与突变体稳定性比较 | 第69-72页 |
| ·半胱氨酸突变体的构建、表达及纯化 | 第72-73页 |
| ·蛋白酶WF146底物结合位点改造 | 第73-75页 |
| ·活性中心突变体构建、表达、纯化及复性 | 第75-77页 |
| ·N末端测序结果 | 第77-79页 |
| 4. 讨论 | 第79-87页 |
| ·蛋白酶WF146自降解机制 | 第79-80页 |
| ·蛋白酶WF146自降解产物性质 | 第80-82页 |
| ·自降解位点引入Pro对抗自降解的影响 | 第82-84页 |
| ·底物结合位点突变 | 第84-85页 |
| ·蛋白酶WF146酶原加工机制 | 第85-87页 |
| 5. 本章小结 | 第87-90页 |
| 第三章 抗自降解突变体N63P/A66P应用研究 | 第90-100页 |
| 1. 实验材料 | 第90-91页 |
| ·质粒 | 第90页 |
| ·药品及试剂 | 第90页 |
| ·溶液配制 | 第90-91页 |
| 2. 实验方法 | 第91-93页 |
| ·角蛋白降解活力测定 | 第91页 |
| ·羽毛处理 | 第91页 |
| ·完整天然羽毛降解 | 第91页 |
| ·羽毛粉降解 | 第91-92页 |
| ·人朊蛋白huPrP(23-231)-P105L突变体表达及包含体处理 | 第92页 |
| ·朊蛋白变性复性 | 第92页 |
| ·朊蛋白降解 | 第92页 |
| ·透射电镜观察 | 第92-93页 |
| 3. 结果与分析 | 第93-98页 |
| ·嗜热蛋白酶WF146对天然鸡毛及鸡毛粉的降解 | 第93-94页 |
| ·高温条件下底物对蛋白酶WF146的保护作用 | 第94-95页 |
| ·嗜热蛋白酶WF146对朊蛋白的降解 | 第95-98页 |
| 4. 讨论 | 第98-99页 |
| ·蛋白酶WF146对角蛋白的降解 | 第98页 |
| ·蛋白酶WF146对朊蛋白的降解 | 第98-99页 |
| 5. 本章小结 | 第99-100页 |
| 第四章 蛋白酶WF146在枯草芽胞杆菌及毕赤酵母中的分泌表达 | 第100-120页 |
| 1. 实验材料 | 第100-102页 |
| ·菌株和质粒 | 第100页 |
| ·药品及试剂 | 第100-101页 |
| ·培养基和溶液配制 | 第101-102页 |
| 2. 实验方法 | 第102-107页 |
| ·Bacillus sp.WF146基因组DNA提取 | 第102-103页 |
| ·枯草芽胞杆菌重组表达质粒构建 | 第103页 |
| ·枯草芽胞杆菌转化 | 第103-104页 |
| ·枯草芽胞杆菌重组菌表达 | 第104页 |
| ·毕赤酵母表达重组质粒构建 | 第104-105页 |
| ·毕赤酵母转化及高表达重组子筛选 | 第105页 |
| ·毕赤酵母重组菌表达 | 第105-106页 |
| ·蛋白质糖基化分析 | 第106页 |
| ·多克隆抗体制备 | 第106-107页 |
| ·Westem blot检测 | 第107页 |
| 3. 结果与分析 | 第107-116页 |
| ·枯草芽胞杆菌表达重组质粒构建 | 第107-109页 |
| ·嗜热蛋白酶WF146在枯草芽胞杆菌DB104中的表达 | 第109-111页 |
| ·毕赤酵母表达重组菌株构建 | 第111-112页 |
| ·嗜热蛋白酶WF146在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第112-113页 |
| ·巴斯德毕赤酵母中的表达产物性质分析 | 第113-116页 |
| 4. 讨论 | 第116-118页 |
| ·蛋白酶WF146在不同表达系统中的表达情况比较 | 第116-117页 |
| ·糖基化对蛋白酶WF146性质的影响 | 第117-118页 |
| 5. 本章小结 | 第118-120页 |
| 本研究总结及展望 | 第120-122页 |
| 参考文献 | 第122-140页 |
| 附录 | 第140-146页 |
| 一. 本研究涉及的所有质粒信息表 | 第140-141页 |
| 二. 本研究所用所有引物信息表 | 第141-143页 |
| 三. 蛋白酶WF146氨基酸序列信息 | 第143-146页 |
| 在读期间已发表论文 | 第146-148页 |
| 致谢 | 第148-149页 |
