| 中文摘要 | 第11-12页 |
| 英文摘要 | 第12-14页 |
| 1 引言 | 第14-24页 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒主要生物学特性研究进展 | 第14-19页 |
| 1.1.1 病毒形态特征及理化特性 | 第14-15页 |
| 1.1.2 病毒培养特性 | 第15页 |
| 1.1.3 PEDV基因组结构 | 第15-16页 |
| 1.1.4 PEDV主要结构蛋白及其功能 | 第16-18页 |
| 1.1.5 PEDV与其它冠状病毒的抗原相关性 | 第18页 |
| 1.1.6 猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究进展 | 第18-19页 |
| 1.2 PED诊断方法的研究进展 | 第19-21页 |
| 1.2.1 免疫电镜法 | 第19页 |
| 1.2.2 免疫荧光法 | 第19页 |
| 1.2.3 微量血清中和试验 | 第19-20页 |
| 1.2.4 ELISA法 | 第20页 |
| 1.2.5 RT-PCR法 | 第20页 |
| 1.2.6 胶体金抗体检测技术(GICA) | 第20-21页 |
| 1.3 单克隆抗体在PEDV中的应用及进展 | 第21-23页 |
| 1.3.1 单抗在蛋白抗原结构和功能分析方面的研究和应用 | 第21页 |
| 1.3.2 单抗在诊断方面的研究和应用 | 第21-22页 |
| 1.3.3 单抗在防治方面的应用 | 第22-23页 |
| 1.4 研究的目的和意义 | 第23-24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-39页 |
| 2.1 材料 | 第24-27页 |
| 2.1.1 菌种 | 第24页 |
| 2.1.2 细胞与病毒 | 第24页 |
| 2.1.3 抗体制剂 | 第24页 |
| 2.1.4 实验动物 | 第24页 |
| 2.1.5 扩增PEDV M基因引物 | 第24-25页 |
| 2.1.6 临床粪便样品 | 第25页 |
| 2.1.7 培养基和主要试剂 | 第25页 |
| 2.1.8 主要试剂的配制 | 第25-27页 |
| 2.1.9 主要仪器设备 | 第27页 |
| 2.2 实验方法 | 第27-29页 |
| 2.2.1 猪流行性腹泻病毒的增殖及其鉴定 | 第27-29页 |
| 2.3 实验动物的免疫 | 第29页 |
| 2.4 间接ELISA方法检测杂交瘤细胞分泌的抗体 | 第29-30页 |
| 2.4.1 阳性血清和阴性血清的制备 | 第29-30页 |
| 2.4.2 间接ELISA检测方法的建立 | 第30页 |
| 2.5 杂交瘤细胞株的制备与筛选 | 第30-32页 |
| 2.5.1 SP2/0骨髓瘤细胞的复苏与培养 | 第30页 |
| 2.5.2 饲养层细胞的制备 | 第30-31页 |
| 2.5.3 脾细胞的制备 | 第31页 |
| 2.5.4 SP2/0骨髓瘤细胞的准备 | 第31页 |
| 2.5.5 细胞融合 | 第31页 |
| 2.5.6 阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆 | 第31-32页 |
| 2.5.7 杂交瘤细胞的冻存与复苏 | 第32页 |
| 2.6 单克隆抗体效价的测定 | 第32页 |
| 2.7 单克隆抗体生物学特性鉴定 | 第32-36页 |
| 2.7.1 单抗亚类鉴定 | 第32页 |
| 2.7.2 杂交瘤细胞染色体数的鉴定 | 第32-33页 |
| 2.7.3 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性测定 | 第33页 |
| 2.7.4 间接免疫荧光试验 | 第33页 |
| 2.7.5 PEDV S蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第33-35页 |
| 2.7.6 Western-blot鉴定单克隆抗体对原核表达的PEDV S蛋白的反应性 | 第35页 |
| 2.7.7 单克隆抗体其它腹泻病毒的反应性 | 第35页 |
| 2.7.8 单克隆抗体叠加试验 | 第35-36页 |
| 2.8 双抗夹心ELISA方法的建立 | 第36-37页 |
| 2.8.1 兔源抗PEDV抗血清适宜稀释倍数的确定 | 第36页 |
| 2.8.2 兔源抗PEDV抗血清适宜的包被条件 | 第36页 |
| 2.8.3 不同封闭液浓度和封闭时间对封闭效果的影响 | 第36页 |
| 2.8.4 夹心抗原作用时间 | 第36-37页 |
| 2.8.5 酶标二抗适宜作用时间的确定 | 第37页 |
| 2.8.6 显色时间的确定 | 第37页 |
| 2.9 ELISA阴、阳性判定标准的确定 | 第37页 |
| 2.10 双抗夹心ELISA病原检测的特异性 | 第37页 |
| 2.11 双抗夹心ELISA病原检测的敏感性 | 第37页 |
| 2.12 抗原捕捉ELISA病原检测的重复性 | 第37-38页 |
| 2.12.1 板内重复性试验 | 第37页 |
| 2.12.2 板间重复性试验 | 第37-38页 |
| 2.13 临床样品处理和双抗夹心ELISA检测 | 第38-39页 |
| 3 结果 | 第39-53页 |
| 3.1 猪流行性腹泻病毒的增殖及鉴定 | 第39-41页 |
| 3.1.1 PEDV的增殖 | 第39页 |
| 3.1.2 猪流行性腹泻病毒的TCID50测定 | 第39页 |
| 3.1.3 猪流行性腹泻病毒的PCR鉴定结果 | 第39-40页 |
| 3.1.4 纯化后PEDV病毒SDS-PAGE鉴定 | 第40-41页 |
| 3.2 间接ELISA检测杂交瘤细胞上清液方法建立 | 第41-42页 |
| 3.3 分泌抗PEDV单克隆抗体杂交瘤细胞株筛选 | 第42页 |
| 3.4 单克隆抗体效价的测定 | 第42-43页 |
| 3.5 单克隆抗体生物学特性鉴定 | 第43-46页 |
| 3.5.1 单克隆抗体亚类鉴定 | 第43页 |
| 3.5.2 杂交瘤细胞染色体计数 | 第43页 |
| 3.5.3 杂交瘤细胞分泌单克隆抗体稳定性测定结果 | 第43-44页 |
| 3.5.4 单克隆抗体与PEDV反应的间接免疫荧光检测结果 | 第44页 |
| 3.5.5 pGEX-6p-S3/ BL21诱导表达PEDV S蛋白的SDS-PAGE分析 | 第44-45页 |
| 3.5.6 McA识别位点的鉴定 | 第45页 |
| 3.5.7 单克隆抗体的特异性鉴定结果 | 第45-46页 |
| 3.5.8 分泌抗体的2株杂交瘤细胞上清液叠加试验分析结果 | 第46页 |
| 3.6 双抗夹心ELISA方法的建立 | 第46-50页 |
| 3.6.1 抗体最佳稀释倍数的确定 | 第46页 |
| 3.6.2 最佳包被条件确定 | 第46-47页 |
| 3.6.3 封闭液的确定 | 第47页 |
| 3.6.4 封闭时间的确定 | 第47-48页 |
| 3.6.5 夹心抗原作用时间的确定 | 第48页 |
| 3.6.6 酶标二抗作用时间的确定 | 第48-49页 |
| 3.6.7 显色时间的确定 | 第49-50页 |
| 3.7 ELISA判定标准的确定 | 第50页 |
| 3.8 特异性试验 | 第50页 |
| 3.9 灵敏性试验 | 第50页 |
| 3.10 抗原捕捉ELISA方法重复性试验 | 第50-51页 |
| 3.11 临床样品检测 | 第51-53页 |
| 4 讨论 | 第53-56页 |
| 4.1 制备抗PEDV单克隆抗体所用免疫原及其单抗基本特性 | 第53页 |
| 4.2 双抗夹心ELISA方法的建立及对病原检测 | 第53-54页 |
| 4.3 单克隆抗体制备过程中的几个重要环节 | 第54-56页 |
| 5 结论 | 第56-57页 |
| 致谢 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-63页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第63页 |
