| 摘要 | 第10-12页 |
| ABSTRACT | 第12-13页 |
| 第1章 绪论 | 第14-26页 |
| 1.1 长链二元酸的生产方法 | 第14-16页 |
| 1.1.1 催化油脂法 | 第14-15页 |
| 1.1.2 化学合成法 | 第15页 |
| 1.1.3 微生物发酵法 | 第15-16页 |
| 1.2 热带假丝酵母的育种方法 | 第16-17页 |
| 1.2.1 诱变育种 | 第16页 |
| 1.2.2 基因工程育种 | 第16-17页 |
| 1.3 产长链二元酸热带假丝酵母菌种的改造 | 第17-23页 |
| 1.3.1 烷烃、油脂在热带假丝酵母中的代谢途径 | 第18-20页 |
| 1.3.2 GK基因 | 第20页 |
| 1.3.3 CRAT基因 | 第20-22页 |
| 1.3.4 P450酶系 | 第22-23页 |
| 1.4 立题背景和研究内容 | 第23-26页 |
| 1.4.1 立题背景 | 第23页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第23-26页 |
| 第2章 热带假丝酵母基因无痕编辑载体pPICPJm的构建 | 第26-40页 |
| 2.1 引言 | 第26页 |
| 2.2 实验材料和设备 | 第26-28页 |
| 2.2.1 菌种、质粒 | 第26-27页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第27页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第27-28页 |
| 2.2.4 培养基 | 第28页 |
| 2.3 实验方法 | 第28-37页 |
| 2.3.1 冻干菌种的恢复培养 | 第28-29页 |
| 2.3.2 Candidalipolytica1457基因组DNA的提取 | 第29页 |
| 2.3.3 pPIC9K质粒的提取 | 第29页 |
| 2.3.4 引物设计 | 第29-30页 |
| 2.3.5 抗性基因kanr的克隆 | 第30-31页 |
| 2.3.6 启动子基因pGAL的克隆 | 第31页 |
| 2.3.7 毒素蛋白基因mazF的克隆 | 第31-32页 |
| 2.3.8 同源重组片段pGAL-mazF的制备 | 第32-33页 |
| 2.3.9 载体pPICzαA的酶切 | 第33页 |
| 2.3.10 去磷酸化 | 第33-34页 |
| 2.3.11 浓缩 | 第34页 |
| 2.3.12 Kanr片段与载体pPICzαA的连接 | 第34-35页 |
| 2.3.13 转化 | 第35页 |
| 2.3.14 阳性重组菌株的筛选 | 第35-36页 |
| 2.3.15 质粒pPICzαA-Kanr的提取 | 第36页 |
| 2.3.16 质粒pPICzαA-Kanr的酶切 | 第36页 |
| 2.3.17 去磷酸化、浓缩 | 第36页 |
| 2.3.18 重叠pGAL-mazF片段与pPICzαA-Kanr的连接 | 第36页 |
| 2.3.19 转化 | 第36页 |
| 2.3.20 阳性重组菌株的筛选 | 第36页 |
| 2.3.21 电转化及阳性重组菌株的鉴定 | 第36-37页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第37-39页 |
| 2.4.1 基因组DNA及质粒的提取结果 | 第37页 |
| 2.4.2 自杀质粒pPICPJm的构建、转化及鉴定 | 第37-39页 |
| 2.4.3 自杀质粒pPICPJm的表达与鉴定 | 第39页 |
| 2.5 总结 | 第39-40页 |
| 第3章 热带假丝酵母GK基因启动子替换工程菌的构建 | 第40-54页 |
| 3.1 引言 | 第40页 |
| 3.2 实验材料 | 第40页 |
| 3.2.1 菌种和质粒 | 第40页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第40页 |
| 3.2.3 主要仪器 | 第40页 |
| 3.2.4 培养基 | 第40页 |
| 3.3 实验方法 | 第40-49页 |
| 3.3.1 C.lipolytica1457基因组DNA的提取 | 第40页 |
| 3.3.2 质粒pPICPJm的提取 | 第40-41页 |
| 3.3.3 引物的设计 | 第41页 |
| 3.3.4 同源臂 gkpF和 gkpR的获取 | 第41-42页 |
| 3.3.5 同源重组片段 gkpF- gkpR的制备 | 第42-43页 |
| 3.3.6 启动子基因pGAP的获取 | 第43页 |
| 3.3.7 重组载体pPICPJm- gkpFR的构建 | 第43-44页 |
| 3.3.8 转化 | 第44页 |
| 3.3.9 阳性重组菌株的筛选 | 第44页 |
| 3.3.10 启动子替换载体pPICPJm- gkp的构建 | 第44-45页 |
| 3.3.11 转化 | 第45页 |
| 3.3.12 阳性重组菌株的筛选 | 第45-46页 |
| 3.3.13 C.tropicalis1798感受态的制备 | 第46页 |
| 3.3.14 电转化及阳性重组菌株的鉴定 | 第46-47页 |
| 3.3.15 种子培养 | 第47-48页 |
| 3.3.16 原始菌株和重组菌株甘油利用分析 | 第48页 |
| 3.3.17 原始菌株和重组菌株的发酵培养与十二碳二元酸的测量 | 第48-49页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第49-52页 |
| 3.4.1 基因组DNA及质粒的提取结果 | 第49页 |
| 3.4.2 启动子替换载体pPICPJm- gkp的构建、电转化及鉴定 | 第49-51页 |
| 3.4.3 C.tropicalis1798和C.tropicalis gkPr生长速率及碳源利用分析 | 第51-52页 |
| 3.4.4 以油脂为底物C.tropicalis1798和C.tropicalis gkPr的发酵验证 | 第52页 |
| 3.5 总结 | 第52-54页 |
| 第4章 热带假丝酵母CRAT基因单拷贝缺失工程菌的构建 | 第54-64页 |
| 4.1 引言 | 第54页 |
| 4.2 主要材料和设备 | 第54页 |
| 4.2.1 菌种 | 第54页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第54页 |
| 4.2.3 主要仪器 | 第54页 |
| 4.2.4 培养基 | 第54页 |
| 4.3 实验方法 | 第54-59页 |
| 4.3.1 C.tropicalis1798基因组DNA的提取 | 第54页 |
| 4.3.2 自杀质粒pPICPJm质粒的提取 | 第54-55页 |
| 4.3.3 引物的设计 | 第55页 |
| 4.3.4 同源臂CRATpF和CRATpR的获取 | 第55-56页 |
| 4.3.5 同源重组片段CRATpF-CRATpR的制备 | 第56-57页 |
| 4.3.6 基因敲除载体pPICPJm-CRAT的构建 | 第57-58页 |
| 4.3.7 转化 | 第58页 |
| 4.3.8 阳性重组菌株的筛选 | 第58-59页 |
| 4.3.9 C.tropicalis gkPr感受态的制备 | 第59页 |
| 4.3.10 电转化及阳性重组菌株的鉴定 | 第59页 |
| 4.3.11 种子培养 | 第59页 |
| 4.3.12 发酵培养及十二碳二元酸的提取与测定 | 第59页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第59-61页 |
| 4.4.1 基因敲除载体pPICPJm-CRAT的构建、电转化及鉴定 | 第59-60页 |
| 4.4.2 C.tropicalis gkPr和C.tropicalis gkPc生长速率分析及发酵验证 | 第60-61页 |
| 4.5 总结 | 第61-64页 |
| 第5章 热带假丝酵母ω-氧化途径增强工程菌的构建 | 第64-72页 |
| 5.1 引言 | 第64页 |
| 5.2 主要材料和设备 | 第64页 |
| 5.2.1 菌种 | 第64页 |
| 5.2.2 主要试剂, | 第64页 |
| 5.2.3 主要仪器 | 第64页 |
| 5.2.4 培养基 | 第64页 |
| 5.3 实验方法 | 第64-67页 |
| 5.3.1 C.tropicalis 1798基因组DNA的提取 | 第64页 |
| 5.3.2 质粒pPICPJm质粒的提取 | 第64-65页 |
| 5.3.3 引物的设计 | 第65页 |
| 5.3.4 同源臂pP450R,pP450F,pNADPH-R,pNADPH-R基因的获取 | 第65页 |
| 5.3.5 同源重组片段pP450F-pP450R,pNADPH-F-pNADPH-R的制备 | 第65页 |
| 5.3.6 启动子基因pGAP的获取 | 第65页 |
| 5.3.7 重组载体pPICPJm-P450pFR,pPICPJm-NADPHpFR的构建 | 第65-66页 |
| 5.3.8 启动子替换载体pPICPJm-P450p,pPICPJm-P450Np的构建 | 第66页 |
| 5.3.9 转化及阳性重组菌株的筛选 | 第66页 |
| 5.3.10 C.tropicalis gkPc感受态的制备 | 第66页 |
| 5.3.11 电转化及阳性重组菌株的鉴定 | 第66-67页 |
| 5.3.12 种子培养 | 第67页 |
| 5.3.13 发酵培养及十二碳二元酸的提取与测定 | 第67页 |
| 5.3.14 5L发酵验证实验 | 第67页 |
| 5.4 实验结果与讨论 | 第67-71页 |
| 5.4.1 启动子替换载体pPICPJm-P450p,pPICPJm-P450Np构建、电转化及鉴定 | 第67-69页 |
| 5.4.2 C.tropicalis1798、C.tropicalis gkPr、C.tropicalis gkPc、C.tropicalisGCPP生长曲线 | 第69-70页 |
| 5.4.3 以油脂为底物C.tropicalisGCPP的发酵验证 | 第70-71页 |
| 5.5 总结 | 第71-72页 |
| 第6章 结论与展望 | 第72-74页 |
| 6.1 结论 | 第72-73页 |
| 6.2 展望 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-80页 |
| 致谢 | 第80-82页 |
| 硕士期间主要科研成果 | 第82页 |
