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产十二碳二元酸Candida tropicalis工程菌的构建及油脂的高效转化研究

摘要第10-12页
ABSTRACT第12-13页
第1章 绪论第14-26页
    1.1 长链二元酸的生产方法第14-16页
        1.1.1 催化油脂法第14-15页
        1.1.2 化学合成法第15页
        1.1.3 微生物发酵法第15-16页
    1.2 热带假丝酵母的育种方法第16-17页
        1.2.1 诱变育种第16页
        1.2.2 基因工程育种第16-17页
    1.3 产长链二元酸热带假丝酵母菌种的改造第17-23页
        1.3.1 烷烃、油脂在热带假丝酵母中的代谢途径第18-20页
        1.3.2 GK基因第20页
        1.3.3 CRAT基因第20-22页
        1.3.4 P450酶系第22-23页
    1.4 立题背景和研究内容第23-26页
        1.4.1 立题背景第23页
        1.4.2 研究内容第23-26页
第2章 热带假丝酵母基因无痕编辑载体pPICPJm的构建第26-40页
    2.1 引言第26页
    2.2 实验材料和设备第26-28页
        2.2.1 菌种、质粒第26-27页
        2.2.2 主要试剂第27页
        2.2.3 主要仪器第27-28页
        2.2.4 培养基第28页
    2.3 实验方法第28-37页
        2.3.1 冻干菌种的恢复培养第28-29页
        2.3.2 Candidalipolytica1457基因组DNA的提取第29页
        2.3.3 pPIC9K质粒的提取第29页
        2.3.4 引物设计第29-30页
        2.3.5 抗性基因kanr的克隆第30-31页
        2.3.6 启动子基因pGAL的克隆第31页
        2.3.7 毒素蛋白基因mazF的克隆第31-32页
        2.3.8 同源重组片段pGAL-mazF的制备第32-33页
        2.3.9 载体pPICzαA的酶切第33页
        2.3.10 去磷酸化第33-34页
        2.3.11 浓缩第34页
        2.3.12 Kanr片段与载体pPICzαA的连接第34-35页
        2.3.13 转化第35页
        2.3.14 阳性重组菌株的筛选第35-36页
        2.3.15 质粒pPICzαA-Kanr的提取第36页
        2.3.16 质粒pPICzαA-Kanr的酶切第36页
        2.3.17 去磷酸化、浓缩第36页
        2.3.18 重叠pGAL-mazF片段与pPICzαA-Kanr的连接第36页
        2.3.19 转化第36页
        2.3.20 阳性重组菌株的筛选第36页
        2.3.21 电转化及阳性重组菌株的鉴定第36-37页
    2.4 结果与讨论第37-39页
        2.4.1 基因组DNA及质粒的提取结果第37页
        2.4.2 自杀质粒pPICPJm的构建、转化及鉴定第37-39页
        2.4.3 自杀质粒pPICPJm的表达与鉴定第39页
    2.5 总结第39-40页
第3章 热带假丝酵母GK基因启动子替换工程菌的构建第40-54页
    3.1 引言第40页
    3.2 实验材料第40页
        3.2.1 菌种和质粒第40页
        3.2.2 主要试剂第40页
        3.2.3 主要仪器第40页
        3.2.4 培养基第40页
    3.3 实验方法第40-49页
        3.3.1 C.lipolytica1457基因组DNA的提取第40页
        3.3.2 质粒pPICPJm的提取第40-41页
        3.3.3 引物的设计第41页
        3.3.4 同源臂 gkpF和 gkpR的获取第41-42页
        3.3.5 同源重组片段 gkpF- gkpR的制备第42-43页
        3.3.6 启动子基因pGAP的获取第43页
        3.3.7 重组载体pPICPJm- gkpFR的构建第43-44页
        3.3.8 转化第44页
        3.3.9 阳性重组菌株的筛选第44页
        3.3.10 启动子替换载体pPICPJm- gkp的构建第44-45页
        3.3.11 转化第45页
        3.3.12 阳性重组菌株的筛选第45-46页
        3.3.13 C.tropicalis1798感受态的制备第46页
        3.3.14 电转化及阳性重组菌株的鉴定第46-47页
        3.3.15 种子培养第47-48页
        3.3.16 原始菌株和重组菌株甘油利用分析第48页
        3.3.17 原始菌株和重组菌株的发酵培养与十二碳二元酸的测量第48-49页
    3.4 实验结果与讨论第49-52页
        3.4.1 基因组DNA及质粒的提取结果第49页
        3.4.2 启动子替换载体pPICPJm- gkp的构建、电转化及鉴定第49-51页
        3.4.3 C.tropicalis1798和C.tropicalis gkPr生长速率及碳源利用分析第51-52页
        3.4.4 以油脂为底物C.tropicalis1798和C.tropicalis gkPr的发酵验证第52页
    3.5 总结第52-54页
第4章 热带假丝酵母CRAT基因单拷贝缺失工程菌的构建第54-64页
    4.1 引言第54页
    4.2 主要材料和设备第54页
        4.2.1 菌种第54页
        4.2.2 主要试剂第54页
        4.2.3 主要仪器第54页
        4.2.4 培养基第54页
    4.3 实验方法第54-59页
        4.3.1 C.tropicalis1798基因组DNA的提取第54页
        4.3.2 自杀质粒pPICPJm质粒的提取第54-55页
        4.3.3 引物的设计第55页
        4.3.4 同源臂CRATpF和CRATpR的获取第55-56页
        4.3.5 同源重组片段CRATpF-CRATpR的制备第56-57页
        4.3.6 基因敲除载体pPICPJm-CRAT的构建第57-58页
        4.3.7 转化第58页
        4.3.8 阳性重组菌株的筛选第58-59页
        4.3.9 C.tropicalis gkPr感受态的制备第59页
        4.3.10 电转化及阳性重组菌株的鉴定第59页
        4.3.11 种子培养第59页
        4.3.12 发酵培养及十二碳二元酸的提取与测定第59页
    4.4 实验结果与讨论第59-61页
        4.4.1 基因敲除载体pPICPJm-CRAT的构建、电转化及鉴定第59-60页
        4.4.2 C.tropicalis gkPr和C.tropicalis gkPc生长速率分析及发酵验证第60-61页
    4.5 总结第61-64页
第5章 热带假丝酵母ω-氧化途径增强工程菌的构建第64-72页
    5.1 引言第64页
    5.2 主要材料和设备第64页
        5.2.1 菌种第64页
        5.2.2 主要试剂,第64页
        5.2.3 主要仪器第64页
        5.2.4 培养基第64页
    5.3 实验方法第64-67页
        5.3.1 C.tropicalis 1798基因组DNA的提取第64页
        5.3.2 质粒pPICPJm质粒的提取第64-65页
        5.3.3 引物的设计第65页
        5.3.4 同源臂pP450R,pP450F,pNADPH-R,pNADPH-R基因的获取第65页
        5.3.5 同源重组片段pP450F-pP450R,pNADPH-F-pNADPH-R的制备第65页
        5.3.6 启动子基因pGAP的获取第65页
        5.3.7 重组载体pPICPJm-P450pFR,pPICPJm-NADPHpFR的构建第65-66页
        5.3.8 启动子替换载体pPICPJm-P450p,pPICPJm-P450Np的构建第66页
        5.3.9 转化及阳性重组菌株的筛选第66页
        5.3.10 C.tropicalis gkPc感受态的制备第66页
        5.3.11 电转化及阳性重组菌株的鉴定第66-67页
        5.3.12 种子培养第67页
        5.3.13 发酵培养及十二碳二元酸的提取与测定第67页
        5.3.14 5L发酵验证实验第67页
    5.4 实验结果与讨论第67-71页
        5.4.1 启动子替换载体pPICPJm-P450p,pPICPJm-P450Np构建、电转化及鉴定第67-69页
        5.4.2 C.tropicalis1798、C.tropicalis gkPr、C.tropicalis gkPc、C.tropicalisGCPP生长曲线第69-70页
        5.4.3 以油脂为底物C.tropicalisGCPP的发酵验证第70-71页
    5.5 总结第71-72页
第6章 结论与展望第72-74页
    6.1 结论第72-73页
    6.2 展望第73-74页
参考文献第74-80页
致谢第80-82页
硕士期间主要科研成果第82页

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