| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略语表(Abbribiations) | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第12-20页 |
| 1.1 古菌概述 | 第12-13页 |
| 1.2 硫化叶菌 | 第13-14页 |
| 1.3 真核生物的ORC复合物 | 第14-15页 |
| 1.4 真核生物的Cdc6蛋白 | 第15-17页 |
| 1.5 古菌的ORC 1/Cdc6 | 第17-19页 |
| 1.6 研究的目的和意义 | 第19-20页 |
| 2 材料与方法 | 第20-36页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第20页 |
| 2.2 培养基及培养条件 | 第20-23页 |
| 2.2.1 大肠杆菌的培养基及培养条件 | 第20-21页 |
| 2.2.2 硫化叶菌的培养基及培养条件 | 第21-23页 |
| 2.3 主要仪器及分子生物学试剂 | 第23-24页 |
| 2.3.1 主要化学药品 | 第23-24页 |
| 2.3.2 主要实验仪器 | 第24页 |
| 2.4 实验方法 | 第24-36页 |
| 2.4.1 冰岛硫化叶菌生长曲线的绘制 | 第24-25页 |
| 2.4.1.1 冰岛硫化叶菌的活化 | 第24-25页 |
| 2.4.1.2 生长曲线的绘制 | 第25页 |
| 2.4.2 E.coli JM109感受态细胞的制备及转化 | 第25-26页 |
| 2.4.2.1 E.coli JM109感受态细胞的制备 | 第25-26页 |
| 2.4.2.2 E.coli JM109的转化 | 第26页 |
| 2.4.3 冰岛硫化叶菌感受态制备及转化 | 第26-27页 |
| 2.4.3.1 冰岛硫化叶菌感受态细胞的制备 | 第26-27页 |
| 2.4.3.2 冰岛硫化叶菌的转化 | 第27页 |
| 2.4.4 质粒的提取和基因组DNA的制备 | 第27-28页 |
| 2.4.5 Cdc6-2蛋白回补质粒与超表达质粒的构建 | 第28页 |
| 2.4.5.1 回补质粒ds-Cdc6-2的构建 | 第28页 |
| 2.4.5.2 超表达质粒ds-50/2-Cdc6-2的构建 | 第28页 |
| 2.4.6 Bradford法测定蛋白浓度 | 第28-29页 |
| 2.4.7 SDS-PAGE电泳和Western-blot实验 | 第29-31页 |
| 2.4.7.1 细胞处理和SDS-PAGE电泳 | 第29-30页 |
| 2.4.7.2 蛋白质的转膜 | 第30页 |
| 2.4.7.3 Western-blot实验 | 第30-31页 |
| 2.4.8 冰岛硫化叶菌总RNA的提取以及RT-qPCR | 第31-32页 |
| 2.4.8.1 冰岛硫化叶菌总RNA的提取 | 第31页 |
| 2.4.8.2 RT-qPCR | 第31-32页 |
| 2.4.9 cdc6-2启动子报告基因质粒的构建及β-半乳糖苷酶活性测定 | 第32-33页 |
| 2.4.9.1 cdc6-2启动子报告基因质粒的构建 | 第32页 |
| 2.4.9.2 β-半乳糖苷酶活性测定 | 第32-33页 |
| 2.4.10 cdc6-2基因在大肠杆菌中表达、EMSA实验 | 第33-34页 |
| 2.4.10.1 cdc6-2基因在大肠杆菌中的表达 | 第33-34页 |
| 2.4.10.2 EMSA实验 | 第34页 |
| 2.4.11 DNase I足迹分析实验(DNase I footprinting assay) | 第34-35页 |
| 2.4.12 D-188-pSeSD-LacS质粒定点突变 | 第35-36页 |
| 3 结果与分析 | 第36-66页 |
| 3.1 古菌中部分菌株Cdc6蛋白的同源性分析 | 第36-38页 |
| 3.2 DNA损伤试剂对cdc6-2缺失株生长的影响 | 第38-39页 |
| 3.3 cdc6-2蛋白的回补与超表达 | 第39-47页 |
| 3.3.1 将cdc6-2基因回补至cdc6-2基因缺失菌株中 | 第39-43页 |
| 3.3.2 Cdc6-2蛋白的超表达 | 第43-47页 |
| 3.4 DNA损伤剂4-NQO处理对E233S中cdc6-2基因转录与表达的影响 | 第47-52页 |
| 3.4.1 4-NQO处理对E233S中cdc6-2基因转录的影响 | 第47-50页 |
| 3.4.2 4-NQO处理对E233S中cdc6-2基因表达量的影响 | 第50-52页 |
| 3.5 报告基因体系分析cdc6-2基因启动子 | 第52-57页 |
| 3.5.1 cdc6-2基因启动子报告基因质粒的构建 | 第52-55页 |
| 3.5.2 报告基因质粒在不同宿主菌中LacS酶活的检测 | 第55-57页 |
| 3.6 Cdc6-2蛋白结合自身启动子并调控自身基因的表达 | 第57-66页 |
| 3.6.1 Cdc6-2蛋白的大肠杆菌表达 | 第57-59页 |
| 3.6.2 Cdc6-2蛋白与cdc6-2启动子的EMSA实验 | 第59-60页 |
| 3.6.3 Cdc6-2蛋白与cdc6-2基因启动子的DNase I footprinting实验 | 第60-64页 |
| 3.6.4 含有cdc6-2突变启动子的报告基因质粒在不同宿主菌中LacS酶活检测 | 第64-66页 |
| 4 讨论 | 第66-68页 |
| 4.1 冰岛硫化叶菌Cdc6-2的分类 | 第66页 |
| 4.2 冰岛硫化叶菌Cdc6-2的功能研究 | 第66-68页 |
| 参考文献 | 第68-74页 |
| 附录 | 第74-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
