| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略语表 | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第12-26页 |
| 1.1 研究背景 | 第12页 |
| 1.2 纳豆激酶简介 | 第12-17页 |
| 1.2.1 纳豆激酶的来源 | 第12-13页 |
| 1.2.2 纳豆激酶的基因结构和化学结构 | 第13-14页 |
| 1.2.3 纳豆激酶的理化性质 | 第14页 |
| 1.2.4 溶栓机制及作为溶栓药物的优点 | 第14-16页 |
| 1.2.5 纳豆激酶活性的测定方法 | 第16-17页 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌表达系统 | 第17-21页 |
| 1.3.1 枯草芽孢杆菌表达系统的优点 | 第18-19页 |
| 1.3.2 枯草芽孢杆菌表达系统的缺点 | 第19页 |
| 1.3.3 枯草芽孢杆菌表达系统的宿主菌株 | 第19页 |
| 1.3.4 枯草芽孢杆菌表达系统的载体 | 第19-20页 |
| 1.3.5 枯草芽孢杆菌的转化方法 | 第20-21页 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌表达系统中的启动子 | 第21-23页 |
| 1.4.1 组成型启动子 | 第21页 |
| 1.4.2 诱导型启动子 | 第21-23页 |
| 1.5 枯草芽孢杆菌的麦芽糖操纵子和麦芽糖代谢 | 第23-24页 |
| 1.6 研究目的及意义 | 第24-26页 |
| 2 材料与方法 | 第26-49页 |
| 2.1 材料 | 第26-30页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第26页 |
| 2.1.2 试剂 | 第26-27页 |
| 2.1.3 生物学软件和网站 | 第27页 |
| 2.1.4 培养基 | 第27-28页 |
| 2.1.5 溶液 | 第28-30页 |
| 2.1.6 仪器设备 | 第30页 |
| 2.2 大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体的构建 | 第30-36页 |
| 2.2.1 穿梭载体各个元件的来源 | 第30-31页 |
| 2.2.2 两步PCR法合成表达框元件 | 第31-33页 |
| 2.2.3 载体与表达框片段的酶切及酶连 | 第33-34页 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态的制备 | 第34页 |
| 2.2.5 大肠杆菌转化及转化子验证 | 第34-36页 |
| 2.2.6 麦芽糖启动子Pglv的定点突变 | 第36页 |
| 2.3 纳豆激酶基因重组枯草芽孢杆菌的构建 | 第36-41页 |
| 2.3.1 纳豆激酶基因的来源 | 第36页 |
| 2.3.2 纳豆激酶基因的克隆 | 第36-37页 |
| 2.3.3 载体与目的片段的酶切与酶连 | 第37-38页 |
| 2.3.4 大肠杆菌的转化及验证 | 第38-39页 |
| 2.3.5 枯草芽孢杆菌感受态的制备 | 第39-40页 |
| 2.3.6 枯草芽孢杆菌的电转化及重组菌株的验证 | 第40-41页 |
| 2.4 琼脂糖-纤维蛋白平板法测定纳豆激酶酶活 | 第41-42页 |
| 2.4.1 尿激酶标准曲线的制作 | 第41-42页 |
| 2.4.2 两菌株产酶能力的初步比较 | 第42页 |
| 2.5 aprN-pMB402-B.subtilis 168菌株诱导表达条件的优化 | 第42-43页 |
| 2.5.1 生长曲线的制作 | 第43页 |
| 2.5.2 麦芽糖诱导物的浓度优化及发酵周期的确定 | 第43页 |
| 2.5.3 诱导时机优化 | 第43页 |
| 2.5.4 最佳诱导条件下两菌株产酶能力的比较 | 第43页 |
| 2.6 发酵工艺优化 | 第43-45页 |
| 2.6.1 培养方式优化 | 第44页 |
| 2.6.2 培养基优化 | 第44-45页 |
| 2.7 重组菌株的高密度发酵及与其他产品的酶活比较 | 第45页 |
| 2.8 纳豆激酶的SDS-PAGE检测 | 第45-48页 |
| 2.8.1 TCA沉淀 | 第46页 |
| 2.8.2 SDS-PAGE检测 | 第46-48页 |
| 2.9 纳豆激酶最适反应条件分析 | 第48-49页 |
| 2.9.1 纳豆激酶的最适反应温度 | 第48页 |
| 2.9.2 纳豆激酶的最适反应pH | 第48-49页 |
| 3 结果与分析 | 第49-67页 |
| 3.1 大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体的构建 | 第49-52页 |
| 3.1.1 两步PCR法合成表达框元件 | 第49-50页 |
| 3.1.2 质粒的构建与验证 | 第50-51页 |
| 3.1.3 pGWB402中Pglv启动子的定点突变 | 第51-52页 |
| 3.2 纳豆激酶枯草芽孢杆菌工程菌的构建 | 第52-55页 |
| 3.2.1 纳豆激酶基因aprN的扩增 | 第52-53页 |
| 3.2.2 重组质粒的构建与验证 | 第53-54页 |
| 3.2.3 重组枯草芽孢杆菌的构建与验证 | 第54-55页 |
| 3.3 琼脂糖-纤维蛋白平板法测定纳豆激酶酶活 | 第55-57页 |
| 3.3.1 尿激酶标准曲线的制作 | 第55-56页 |
| 3.3.2 两菌株产酶能力的初步比较 | 第56-57页 |
| 3.4 aprN-pMB402-B. subtilis 168菌株诱导表达条件的优化 | 第57-60页 |
| 3.4.1 生长曲线的制作 | 第57页 |
| 3.4.2 麦芽糖诱导物的浓度优化及发酵周期的确定 | 第57-58页 |
| 3.4.3 诱导时机优化 | 第58-59页 |
| 3.4.4 最佳诱导条件下两菌株产酶能力的比较 | 第59-60页 |
| 3.5 发酵工艺优化 | 第60-63页 |
| 3.5.1 培养方式优化 | 第60-61页 |
| 3.5.2 培养基优化 | 第61-63页 |
| 3.6 重组菌株的高密度发酵及与其他产品酶活的比较 | 第63-65页 |
| 3.7 纳豆激酶的SDS-PAGE检测 | 第65页 |
| 3.8 纳豆激酶最适反应条件分析 | 第65-67页 |
| 3.8.1 纳豆激酶的最适反应温度 | 第65-66页 |
| 3.8.2 纳豆激酶的最适反应pH | 第66-67页 |
| 4 总结与讨论 | 第67-70页 |
| 4.1 大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体的构建 | 第67页 |
| 4.2 诱导表达条件的优化 | 第67-68页 |
| 4.3 发酵工艺优化 | 第68页 |
| 4.4 重组菌株的高密度发酵及与其他产品酶活的比较 | 第68-70页 |
| 参考文献 | 第70-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 附录 | 第79页 |
