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成纤维生长因子21和AdipoRon调控脂肪细胞分化及脂质代谢的机理研究

摘要第10-13页
Abstract第13-15页
缩略词中英文对照表第16-18页
第一章 文献综述第18-39页
    1 前言第18-19页
        1.1 脂肪组织的形成第18-19页
        1.2 白色、棕色以及米色脂肪细胞第19页
    2 不同组织中脂质的作用第19-23页
        2.1 脂肪组织的异位积累第20页
        2.2 肝脏中甘油三酯第20-21页
        2.3 血管外周及心外膜脂质第21-22页
        2.4 血管周脂肪组织第22页
        2.5 心肌脂肪第22-23页
    3 脂质代谢调控第23-25页
        3.1 脂质生成的定义第23页
        3.2 脂质生成的转录调控第23-24页
        3.3 脂质生成的后转录调控第24页
        3.4 脂质生成的激素调节第24-25页
    4 骨骼肌肌内脂肪沉积第25-26页
        4.1 肌内脂肪与胰岛素抵抗第25页
        4.2 现代猪育种追求高肌内脂肪含量第25-26页
        4.3 寻找肌内脂肪maker是现代猪育种趋势第26页
    5FGF21第26-32页
        5.1 FGF21生物学功能第27页
        5.2 调节FGF21生物学功能的受体第27-28页
        5.3 FGF21在机体不同组织中的调节作用第28-32页
            5.3.1 FGF21在肝脏中的作用第28页
            5.3.2 FGF21信号转导机制第28-29页
            5.3.3 FGF21对于糖脂类代谢的调节机制第29页
            5.3.4 FGF21在白色脂肪中的作用第29-30页
            5.3.5 FGF21作用于中枢神经调控脂质代谢第30-31页
            5.3.6 FGF21在胰腺中的作用第31-32页
        5.4 FGF21参与肌肉发育和肌内脂肪代谢第32页
    6 脂联素与其受体激动剂AdipoRon第32-38页
        6.1 脂联素的结构、合成和转录修饰第33-34页
        6.2 脂联素受体第34页
        6.3 脂联素下游信号第34-36页
        6.4 在关键代谢组织中的脂联素信号第36-37页
            6.4.1 脂联素信号在骨骼肌中的作用第36-37页
            6.4.2 脂联素在脂肪细胞和脂肪组织中的作用第37页
        6.5 脂联素受体激动剂AdipoRon第37-38页
            6.5.1 AdipoRon和胰岛素抵抗第37页
            6.5.2 AdipoRon与心血管功能第37-38页
    7 研究目的与意义第38-39页
第二章 材料与方法第39-77页
    1 实验材料第39-44页
        1.1 细胞株和细胞系第39页
        1.2 载体第39页
        1.3 主要仪器与设备第39-40页
        1.4 主要试剂及耗材第40-42页
        1.5 常用试剂及其配置第42-44页
        1.6 主要分子生物学软件及数据库第44页
    2 实验方法第44-77页
        2.1 猪胎儿肌内前体脂肪细胞(IMF)株的建立与培养第44-46页
            2.1.1 猪IMF细胞株的建立第44-45页
            2.1.2 猪IMF细胞株的传代第45页
            2.1.3 猪IMF细胞株的冷冻第45-46页
            2.1.4 猪IMF细胞株的鉴定第46页
        2.2 猪源FGF21稳转细胞株第46-53页
            2.2.1 猪源FGF21基因全长CDS序列的PCR扩增第46-47页
            2.2.2 PCR产物的凝胶电泳及回收第47-48页
            2.2.3 回收的DNA片段的TA克隆与转化第48-49页
            2.2.4 TA阳性克隆的筛选检测与测序第49页
            2.2.5 含目的基因的T载体的质粒提取第49-50页
            2.2.6 目的基因真核表达载体的构建第50-52页
            2.2.7 质粒的双酶切验证第52页
            2.2.8 含猪FGF21基因CDS序列的质粒的瞬时转染第52-53页
        2.3 超表达猪FGF21基因的稳定细胞株的筛选第53-58页
            2.3.1 细胞转染第53-54页
            2.3.2 细胞总RNA的提取第54-55页
            2.3.3 单链cDNA的合成第55页
            2.3.4 实时定量PCR第55-56页
            2.3.5 细胞总蛋白质的提取第56-57页
            2.3.6 蛋白质免疫印迹WesternBlot第57-58页
        2.4 稳定细胞株中FGF21对成脂分化基因的调控第58-60页
        2.5 CEBPβ启动子区DNA甲基化分析第60-64页
            2.5.1 CEBPβ启动子区域DNA的处理第60-61页
            2.5.2 PCR扩增第61-62页
            2.5.3 PCR产物的回收第62-63页
            2.5.4 目的片段与T载体连接第63页
            2.5.5 阳性菌落的筛选与测序第63页
            2.5.6 甲基化结果分析第63-64页
        2.6 电泳迁移率实验(ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA)第64-68页
        2.7 染色质免疫沉淀(ChromatinImmunoprecipitationAssay)第68-70页
            2.7.1 交联与细胞裂解第68页
            2.7.2 酶解断裂染色质第68-69页
            2.7.3 免疫沉淀蛋白-DNA复合物第69页
            2.7.4 65?C解交联蛋白质和DNA复合物第69-70页
            2.7.5 消化蛋白,纯化富集的DNA第70页
        2.8 AdipoRon药物处理第70-71页
        2.9 代谢笼实验第71页
        2.10 肝脏和白色脂肪组织westernblot第71页
        2.11 高胰岛素-正常血糖钳夹实验(Hyperinsulinemic–EuglycemicClamp)第71-76页
            2.11.1 小鼠插管手术第71页
            2.11.2 Hyperinsulinemic–EuglycemicClamp(以下简称clamp)第71-73页
            2.11.3 TracerAssay([3-3H]glucose,2-[14C]DG,and3H2O)第73页
            2.11.4 FGF21的酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)试验第73-74页
            2.11.5 血清游离脂肪酸(NEFA)浓度测定第74-75页
            2.11.6 Palmitateturnover第75页
            2.11.7 AcetylCoAturnover第75-76页
            2.11.8 Glycerolturnover第76页
        2.12 数据统计分析方法第76-77页
第三章 结果与分析第77-93页
    1 肌内脂肪(IMF)原代细胞的建立与鉴定第77-78页
        1.1 IMF原代细胞的分离与培养第77页
        1.2 IMF细胞株的鉴定第77-78页
    2 FGF21抑制前体脂肪细胞的成脂分化第78-84页
        2.1 FGF21稳转细胞株的建立第78页
        2.2 FGF21抑制IMF细胞成脂分化第78-82页
            2.2.1 FGF21抑制IMF细胞脂滴的形成第78-79页
            2.2.2 FGF21抑制甘油三酯合成相关基因的表达第79-82页
        2.3 转录因子CEBPβ抑制FGF21基因的转录第82-84页
    3 AdipoRon没有改变白色脂肪组织分解代谢作用第84-87页
        3.1 AdipoRon没有改变低脂饲料喂养小鼠白色脂肪组织脂肪分解第84-85页
        3.2 AdipoRon没有改变clamp实验中葡萄糖注射速率第85-86页
        3.3 AdipoRon没有改变低脂饲喂小鼠的肝脏胰岛素敏感性第86-87页
    4 AdipoRon抑制高脂饮食小鼠白色脂肪组织中脂解作用第87-92页
        4.1 AdipoRon提高小鼠白色脂肪组织含量第87-88页
        4.2 AdipoRon提高clamp中葡萄糖注射速率第88-89页
        4.3 AdipoRon抑制clamp中内源葡萄糖的产生第89-90页
        4.4 AdipoRon抑制游离脂肪酸的产生第90页
        4.5 AdipoRon降低棕榈酸和甘油的代谢率第90-91页
        4.6 AdipoRon降低肝脏内乙酰辅酶A含量第91-92页
    5 AdipoRon加强PPARα-FGF21信号抑制脂肪分解第92-93页
第四章 讨论第93-100页
    1 FGF21下调脂肪细胞分化关键基因第93-94页
    2 FGF21参与脂分化关键基因的表达调控第94-95页
    3 FGF21减少肌肉内甘油三酯的沉积第95页
    4 FGF21激活FGFR信号通路第95-97页
    5 AdipoRon不改变低脂饲喂小鼠白色脂肪组织脂肪分解作用第97页
    6 AdipoRon抑制高脂饲喂小鼠白色脂肪组织脂肪分解作用第97-100页
第五章 结论第100-102页
    1 本研究得到的结论第100页
    2 本研究的创新点与特色第100-101页
    3 不足之处第101页
    4 下一步计划第101-102页
参考文献第102-130页
在读期间发表论文列表第130-132页
致谢第132-134页

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