| 摘要 | 第11-14页 |
| Abstract | 第14-17页 |
| 缩写词表 | 第18-20页 |
| 第一章 文献综述 | 第20-34页 |
| 1 奶牛妊娠建立及其相关调控通路和分子 | 第20-25页 |
| 1.1 奶牛妊娠的建立 | 第20-21页 |
| 1.2 妊娠相关调控通路 | 第21-24页 |
| 1.3 妊娠相关的其他调控分子 | 第24-25页 |
| 2 主要组织相容性复合体Ⅰ类分子对奶牛妊娠建立的生物学作用 | 第25-28页 |
| 2.1 MHC | 第25-26页 |
| 2.2 BoLA-Ⅰ | 第26-28页 |
| 2.2.1 BoLA | 第26-27页 |
| 2.2.2 MIC1 | 第27-28页 |
| 3 IFN-τ及其功能 | 第28-29页 |
| 4 miRNA与妊娠调控 | 第29-32页 |
| 4.1 miRNA | 第29-30页 |
| 4.2 miRNA对妊娠的调节作用 | 第30-32页 |
| 4.2.1 miRNA-145 | 第31-32页 |
| 4.2.2 miRNA-204 | 第32页 |
| 5 研究的目的意义 | 第32-34页 |
| 第二章 奶牛子宫内膜中IFN-τ、bta-miR-145、bta-miR-204和BoLA-Ⅰ表达水平研究 | 第34-48页 |
| 1 前言 | 第34-35页 |
| 2 实验材料与方法 | 第35-43页 |
| 2.1 实验材料 | 第35-38页 |
| 2.1.1 组织样品 | 第35页 |
| 2.1.2 主要仪器设备 | 第35-36页 |
| 2.1.3 主要试剂与耗材 | 第36页 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 | 第36-38页 |
| 2.2 实验方法 | 第38-43页 |
| 2.2.1 样品的预处理 | 第38页 |
| 2.2.2 引物设计 | 第38-39页 |
| 2.2.3 总RNA的提取与反转录 | 第39-41页 |
| 2.2.4 RT-qPCR检测 | 第41-42页 |
| 2.2.5 组织蛋白的提取及Western blot分析 | 第42-43页 |
| 2.2.6 数据分析处理 | 第43页 |
| 3 实验结果 | 第43-45页 |
| 3.1 奶牛子宫内膜组织中bta-miR-145和bta-miR-204的表达变化 | 第43-44页 |
| 3.2 奶牛子宫内膜组织中MIC1和BoLA的表达情况 | 第44页 |
| 3.3 奶牛子宫内膜组织中IFN-τ和BoLA-Ⅰ的表达 | 第44-45页 |
| 4 讨论 | 第45-47页 |
| 5 小结 | 第47-48页 |
| 第三章 IFN-τ对奶牛子宫内膜上皮细胞bta-miR-145、bta-miR-204和BoLA-Ⅰ表达水平的影响 | 第48-61页 |
| 1 前言 | 第48-49页 |
| 2 实验材料与方法 | 第49-55页 |
| 2.1 实验材料 | 第49-52页 |
| 2.1.1 实验样本 | 第49页 |
| 2.1.2 主要仪器设备 | 第49-50页 |
| 2.1.3 主要试剂与耗材 | 第50-51页 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 | 第51-52页 |
| 2.2 实验方法 | 第52-55页 |
| 2.2.1 样品的预处理 | 第52页 |
| 2.2.2 奶牛子宫内膜上皮细胞原代培养与传代 | 第52-53页 |
| 2.2.3 细胞鉴定 | 第53-54页 |
| 2.2.4 实验细胞的处理 | 第54页 |
| 2.2.5 细胞总RNA的提取与反转录 | 第54-55页 |
| 2.2.7 RT-qPCR检测 | 第55页 |
| 2.2.8 细胞蛋白的提取及Western blot分析 | 第55页 |
| 2.2.9 数据分析处理 | 第55页 |
| 3 实验结果 | 第55-59页 |
| 3.1 奶牛子宫内膜上皮细胞的原代培养与传代 | 第55-56页 |
| 3.2 细胞鉴定结果 | 第56-57页 |
| 3.3 IFN-τ对奶牛子宫内膜上皮细胞中bta-miRNA-145和bta-miRNA-204表达的影响 | 第57页 |
| 3.4 IFN-τ对奶牛子宫内膜上皮细胞中MIC1和BoLA表达的影响 | 第57-58页 |
| 3.6 IFN-τ对奶牛子宫内膜上皮细胞中BoLA-Ⅰ表达的影响 | 第58-59页 |
| 4 讨论 | 第59-60页 |
| 5 小结 | 第60-61页 |
| 第四章 bta-miR-145在IFN-τ调控MIC1分子中的作用及其功能研究 | 第61-90页 |
| 1 前言 | 第61-62页 |
| 2 实验材料与方法 | 第62-77页 |
| 2.1 实验材料 | 第62-65页 |
| 2.1.1 实验样本 | 第62页 |
| 2.1.2 主要仪器设备 | 第62-63页 |
| 2.1.3 主要试剂与耗材 | 第63-64页 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 | 第64页 |
| 2.1.5 生物信息学分析相关软件及数据库 | 第64-65页 |
| 2.2 实验方法 | 第65-77页 |
| 2.2.1 靶基因的预测与分析 | 第65页 |
| 2.2.2 MIC1 3'-UTR和Mut-MIC1 3'-UTR双荧光素酶报告基因载体的构建 | 第65-70页 |
| 2.2.3 双荧光素酶报告基因的检测 | 第70-73页 |
| 2.2.3.1 奶牛子宫内膜上皮细胞的培养 | 第70-71页 |
| 2.2.3.2 去内毒素质粒的制备 | 第71-72页 |
| 2.2.3.3 脂质体介导的细胞转染 | 第72页 |
| 2.2.3.4 双荧光素酶报告基因检测 | 第72-73页 |
| 2.2.4 bta-miR-145模拟物和抑制剂转染奶牛子宫内膜上皮细胞 | 第73-74页 |
| 2.2.5 siRNA干扰MIC1及IFN-τ处理后对奶牛子宫内膜上皮细胞的影响 | 第74-77页 |
| 2.2.6 细胞活性检测 | 第77页 |
| 3 实验结果 | 第77-87页 |
| 3.1 靶基因的预测结果与分析 | 第77-78页 |
| 3.2 MIC1 3'-UTR双荧光素酶报告基因载体的构建 | 第78-81页 |
| 3.2.1 MIC1 3'-UTR和Mut-MIC1 3'-UTR序列的扩增 | 第78-79页 |
| 3.2.2 T-MIC1 3'-UTR和T-MIC1 3'-UTR-Mut重组质粒的双酶切鉴定 | 第79页 |
| 3.2.3 psi-CHECK~(TM)-2-MIC1 3'-UTR和psi-CHECK~(TM)-2-MIC1 3'-UTR-Mut重组质粒的双酶切鉴定 | 第79-80页 |
| 3.2.4 psi-CHECK~(TM)-2-MIC1 3'-UTR和psi-CHECK~(TM)-2-MIC1 3'-UTR-Mut重组质粒的测序 | 第80-81页 |
| 3.3 双荧光素酶报告基因的检测 | 第81-82页 |
| 3.4 奶牛子宫内膜上皮细胞转染bta-miR-145模拟物和抑制剂后MIC1的相对表达量 | 第82-84页 |
| 3.5 奶牛子宫内膜上皮细胞转染bta-miR-145模拟物和抑制剂后对bta-miR-204的影响 | 第84页 |
| 3.6 siRNA干扰MIC1及IFN-τ处理后奶牛子宫内膜上皮细胞的影响 | 第84-86页 |
| 3.6.1 最佳siRNA的筛选 | 第84-85页 |
| 3.6.2 siRNA干扰MIC1及IFN-τ处理后奶牛子宫内膜上皮细胞中ADAM 10和ADAM 17的相对表达量 | 第85-86页 |
| 3.7 IFN-τ处理、转染bta-miR-145模拟物和抑制剂及siRNA后对奶牛子宫内膜上皮细胞活性的影响 | 第86-87页 |
| 4 讨论 | 第87-89页 |
| 5 小结 | 第89-90页 |
| 第五章 bta-miR-204在IFN-τ调控BoLA分子中的作用及其功能研究 | 第90-109页 |
| 1 前言 | 第90页 |
| 2 实验材料与方法 | 第90-97页 |
| 2.1 实验材料 | 第90-91页 |
| 2.1.1 实验样本 | 第90-91页 |
| 2.1.2 主要仪器设备 | 第91页 |
| 2.1.3 主要试剂与耗材 | 第91页 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 | 第91页 |
| 2.1.5 生物信息学分析相关软件及数据库 | 第91页 |
| 2.2 实验方法 | 第91-97页 |
| 2.2.1 靶基因的预测与分析 | 第91页 |
| 2.2.2 BoLA 3'-UTR和Mut-BoLA 3'-UTR双荧光素酶报告基因载体的构建 | 第91-94页 |
| 2.2.3 双荧光素酶报告基因的检测 | 第94页 |
| 2.2.4 bta-miR-204模拟物和抑制剂转染奶牛子宫内膜上皮细胞 | 第94-95页 |
| 2.2.5 siRNA干扰BoLA及IFN-τ处理后对奶牛子宫内膜上皮细胞的影响 | 第95-96页 |
| 2.2.5.1 siRNA的设计与合成 | 第95-96页 |
| 2.2.5.2 siRNA转染条件优化 | 第96页 |
| 2.2.5.3 转染奶牛子宫内膜上皮细胞 | 第96页 |
| 2.2.5.4 检测siRNA干扰和IFN-τ处理后子宫内膜上皮细胞中相关基因的表达量 | 第96页 |
| 2.2.6 细胞活性检测 | 第96-97页 |
| 3 实验结果 | 第97-106页 |
| 3.1 靶基因的预测结果与分析 | 第97页 |
| 3.2 BoLA 3'-UTR双荧光素酶报告基因载体的构建 | 第97-100页 |
| 3.2.1 BoLA 3'-UTR和Mut-BoLA 3'-UTR序列的扩增 | 第97-98页 |
| 3.2.2 T-BoLA 3'-UTR和T-BoLA 3'-UTR-Mut重组质粒的双酶切鉴定 | 第98-99页 |
| 3.2.3 psi-CHECK~(TM)-2-BoLA 3'-UTR和psi-CHECK~(TM)-2-BoLA 3'-UTR-Mut重组质粒的双酶切鉴定 | 第99页 |
| 3.2.4 psi-CHECK~(TM)-2-BoLA 3'-UTR和psi-CHECK~(TM)-2-BoLA 3'-UTR-Mut重组质粒的测序 | 第99-100页 |
| 3.3 双荧光素酶报告基因的检测 | 第100-101页 |
| 3.4 奶牛子宫内膜上皮细胞转染bta-miR-204模拟物和抑制剂后BoLA的相对表达量 | 第101-103页 |
| 3.5 奶牛子宫内膜上皮细胞转染bta-miR-204模拟物和抑制剂后对bta-miR-145的影响 | 第103页 |
| 3.6 siRNA干扰BoLA及IFN-τ处理后奶牛子宫内膜上皮细胞的影响 | 第103-105页 |
| 3.6.1 最佳siRNA的筛选 | 第103-104页 |
| 3.6.2 siRNA干扰BoLA及IFN-τ处理后奶牛子宫内膜上皮细胞中PD-L1和PD-L2的相对表达量 | 第104-105页 |
| 3.7 IFN-τ处理、转染bta-miRNA-204模拟物和抑制剂及siRNA对奶牛子宫内膜上皮细胞活性的影响 | 第105-106页 |
| 4 讨论 | 第106-108页 |
| 5 小结 | 第108-109页 |
| 第六章 IFN-τ对LPS诱导小鼠胚胎植入障碍的保护作用 | 第109-117页 |
| 1 前言 | 第109-110页 |
| 2 实验材料与方法 | 第110-113页 |
| 2.1 实验材料 | 第110-111页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第110页 |
| 2.1.2 主要试剂与耗材 | 第110页 |
| 2.1.3 主要溶液的配制 | 第110-111页 |
| 2.2 实验方法 | 第111-113页 |
| 2.2.1 IFN-τ对LPS诱导小鼠胚胎植入障碍的影响 | 第111-112页 |
| 2.2.2 IFN-τ对LPS诱导小鼠子宫内膜炎性因子的影响 | 第112-113页 |
| 2.2.3 数据分析 | 第113页 |
| 3 实验结果 | 第113-114页 |
| 3.1 IFN-τ对小鼠胚胎植入的影响 | 第113页 |
| 3.2 IFN-τ对小鼠子宫内膜组织中IL-1β、TNF-α和IL-10的表达的影响 | 第113-114页 |
| 4 讨论 | 第114-116页 |
| 5 小结 | 第116-117页 |
| 第七章 结论与展望 | 第117-119页 |
| 1 结论 | 第117页 |
| 2 展望 | 第117-119页 |
| 参考文献 | 第119-132页 |
| 附录 | 第132-133页 |
| 致谢 | 第133-134页 |
