| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 第1章 绪论 | 第9-26页 |
| 1.1 课题研究的背景及意义 | 第9页 |
| 1.2 CRISPR/Cas系统 | 第9-14页 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas系统的结构与组成 | 第9-10页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas系统的作用机制 | 第10-12页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas系统的分类 | 第12-13页 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas系统的应用 | 第13-14页 |
| 1.3CRISPR/Cas9 | 第14-19页 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9的研究背景 | 第14页 |
| 1.3.2 S.pyogenesCas9及其核酸复合物的结构分析 | 第14-17页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9与ZFN和TALEN的比较 | 第17-19页 |
| 1.4 CRISPR/Cas系统与噬菌体的共进化 | 第19-21页 |
| 1.4.1 细菌对抗噬菌体的防御系统 | 第19-20页 |
| 1.4.2 噬菌体抵抗细菌的防御系统 | 第20-21页 |
| 1.5 CRISPR/Cas9的脱靶效应 | 第21-23页 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9系统存在脱靶效应的原因 | 第22页 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas9系统中脱靶效应的机制研究 | 第22页 |
| 1.5.3 脱靶检测方法 | 第22-23页 |
| 1.6 小分子作用于CRISPR/Cas9系统的研究 | 第23-24页 |
| 1.6.1 小分子促进CRISPR/Cas9系统的研究 | 第23-24页 |
| 1.6.2 小分子抑制CRISPR/Cas9系统的研究 | 第24页 |
| 1.6.3 小分子降低CRISPR/Cas9系统脱靶效应的研究 | 第24页 |
| 1.7 本文的主要研究内容 | 第24-26页 |
| 第2章 实验材料试剂与方法 | 第26-42页 |
| 2.1 实验材料 | 第26页 |
| 2.1.1 蛋白质的原核表达系统 | 第26页 |
| 2.1.2 小分子药物 | 第26页 |
| 2.2 实验试剂 | 第26-27页 |
| 2.2.1 克隆阶段所用试剂 | 第26页 |
| 2.2.2 RNA纯化所用试剂 | 第26-27页 |
| 2.2.3 蛋白纯化所用试剂 | 第27页 |
| 2.2.4 其他试剂 | 第27页 |
| 2.3 主要实验仪器 | 第27-28页 |
| 2.4 实验方法 | 第28-42页 |
| 2.4.1 构建表达载体 | 第28-31页 |
| 2.4.2 S.pyogenesCas9蛋白的表达方法 | 第31-32页 |
| 2.4.3 S.pyogenesCas9蛋白的纯化方法 | 第32页 |
| 2.4.4 S.pyogenesCas9蛋白位点突变及表达与纯化 | 第32-33页 |
| 2.4.5 sgRNA的体外纯化方法 | 第33-38页 |
| 2.4.6 S.pyogenesCas9-sgRNA复合物的纯化 | 第38页 |
| 2.4.7 小分子药物的筛选 | 第38-39页 |
| 2.4.8 GST-Pulldown实验 | 第39-40页 |
| 2.4.9 EMSA实验 | 第40-41页 |
| 2.4.10 蛋白结晶 | 第41-42页 |
| 第3章 S.pyogenesCas9蛋白的表达与纯化 | 第42-51页 |
| 3.1 引言 | 第42页 |
| 3.2 野生型S.pyogenesCas9蛋白的表达与纯化 | 第42-45页 |
| 3.2.1 重组质粒的构建 | 第42页 |
| 3.2.2 野生型S.pyogenesCas9蛋白的表达 | 第42-43页 |
| 3.2.3 野生型S.pyogenesCas9蛋白的纯化 | 第43-45页 |
| 3.3 突变型S.pyogenesCas9蛋白的表达与纯化 | 第45-47页 |
| 3.4 sgRNA的体外纯化 | 第47-48页 |
| 3.5 S.pyogenesCas9-sgRNA和S.pyogenesCas9-sgRNA-DNA的纯化 | 第48-50页 |
| 3.6 讨论 | 第50页 |
| 3.7 本章小结 | 第50-51页 |
| 第4章 抑制剂的筛选及其作用原理 | 第51-58页 |
| 4.1 引言 | 第51页 |
| 4.2 前期小分子化合物的筛选 | 第51-53页 |
| 4.3 小分子化合物抑制原理的探究 | 第53-56页 |
| 4.3.1 GST-Pulldown探究小分子化合物抑制原理 | 第53-54页 |
| 4.3.2 EMSA探究小分子化合物抑制原理 | 第54-55页 |
| 4.3.3 S.pyogenesCas9与小分子化合物晶体的获得 | 第55-56页 |
| 4.4 讨论 | 第56-57页 |
| 4.5 本章小结 | 第57-58页 |
| 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
