| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略词表 | 第11-12页 |
| 第一章 猪细环病毒研究进展 | 第12-22页 |
| 1.1 病原学 | 第12-14页 |
| 1.1.1 形态结构和理化性质 | 第12页 |
| 1.1.2 培养特性 | 第12-13页 |
| 1.1.3 TTSuV的分型 | 第13页 |
| 1.1.4 TTSu V基因组结构特征 | 第13-14页 |
| 1.2 TTSuV的流行病学 | 第14-17页 |
| 1.2.1 国内流行情况 | 第15页 |
| 1.2.2 国外流行情况 | 第15-16页 |
| 1.2.3 传播方式 | 第16页 |
| 1.2.4 致病性 | 第16-17页 |
| 1.3 TTSuV检测方法的研究进展 | 第17-21页 |
| 1.3.1 TTSu V分子生物学检测方法 | 第17-19页 |
| 1.3.2 血清学诊断方法 | 第19页 |
| 1.3.3 病理组织学诊断 | 第19-20页 |
| 1.3.4 动物模型的建立 | 第20页 |
| 1.3.5 免疫电镜技术 | 第20-21页 |
| 1.4 研究目的及意义 | 第21-22页 |
| 第二章 环介导等温扩增技术简介 | 第22-27页 |
| 2.1 LAMP反应原理 | 第22-24页 |
| 2.2 LAMP技术要点及注意事项 | 第24-25页 |
| 2.2.1 靶序列的选择 | 第24页 |
| 2.2.2 引物设计 | 第24-25页 |
| 2.2.3 反应体系和程序 | 第25页 |
| 2.2.4 注意事项 | 第25页 |
| 2.3 RT-LAMP | 第25页 |
| 2.4 反应产物的检测 | 第25页 |
| 2.5 反应特点 | 第25-26页 |
| 2.6 不足之处 | 第26页 |
| 2.7 技术运用 | 第26页 |
| 2.8 未来展望 | 第26-27页 |
| 第三章 猪细环病毒2型ORF1基因序列分析 | 第27-38页 |
| 3.1 材料 | 第27-28页 |
| 3.1.1 临床样品和载体 | 第27-28页 |
| 3.1.2 主要生化试剂 | 第28页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第28页 |
| 3.1.4 常用试剂、培养基的配制 | 第28页 |
| 3.2 方法 | 第28-31页 |
| 3.2.1 DNA的提取 | 第28-29页 |
| 3.2.2 引物设计 | 第29页 |
| 3.2.3 TTSu V2 ORF1基因的克隆 | 第29页 |
| 3.2.4 目的产物胶回收 | 第29页 |
| 3.2.5 目的基因T-A克隆 | 第29页 |
| 3.2.6 连接产物的转化 | 第29-30页 |
| 3.2.7 菌液PCR鉴定与序列测定 | 第30页 |
| 3.2.8 TTSu V2 ORF1基因生物信息学分析 | 第30页 |
| 3.2.9 TTSu V2 ORF1编码蛋白质结构与功能预测 | 第30-31页 |
| 3.3 结果 | 第31-36页 |
| 3.3.1 TTSu V2 ORF1基因的克隆 | 第31页 |
| 3.3.2 重组克隆质粒PCR鉴定与测序结果 | 第31-32页 |
| 3.3.3 TTSuV2 ORF1基因生物信息学分析 | 第32-34页 |
| 3.3.4 TTSu V2-ORF1编码蛋白质结构和功能分析 | 第34-36页 |
| 3.4 讨论 | 第36-38页 |
| 第四章 TTSuV2 ORF1截短基因的原核表达 | 第38-54页 |
| 4.1 材料 | 第38-40页 |
| 4.1.1 阳性质粒、血清、载体和感受态细胞 | 第38页 |
| 4.1.2 主要生化试剂 | 第38-39页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第39页 |
| 4.1.4 琼脂糖凝胶电泳试剂配制 | 第39页 |
| 4.1.5 SDS-PAGE试剂配制 | 第39-40页 |
| 4.1.6 蛋白纯化试剂的配制 | 第40页 |
| 4.1.7 Western blot试剂配制 | 第40页 |
| 4.2 方法 | 第40-46页 |
| 4.2.1 引物设计 | 第40页 |
| 4.2.2 TTSu V2截短基因的克隆 | 第40-41页 |
| 4.2.3 目的产物胶回收 | 第41页 |
| 4.2.4 目的基因T-A克隆 | 第41页 |
| 4.2.5 连接产物的转化 | 第41页 |
| 4.2.6 重组克隆菌的PCR鉴定 | 第41-42页 |
| 4.2.7 重组克隆质粒的双酶切鉴定 | 第42页 |
| 4.2.8 重组表达质粒pcold-TTSuV2-ORF1的构建 | 第42-43页 |
| 4.2.9 重组蛋白的诱导表达 | 第43-45页 |
| 4.2.10 重组蛋白的纯化 | 第45页 |
| 4.2.11 重组蛋白浓度的测定 | 第45页 |
| 4.2.12 重组蛋白Western blot分析 | 第45-46页 |
| 4.3 结果 | 第46-52页 |
| 4.3.1 目的基因的扩增 | 第46页 |
| 4.3.2 重组克隆质粒p MD-TTSu V2的鉴定 | 第46-48页 |
| 4.3.3 重组表达质粒pcold-TTSuV2-ORF1的构建 | 第48-49页 |
| 4.3.4 重组表达质粒pcold-TTSuV2-ORF1的鉴定 | 第49页 |
| 4.3.5 重组蛋白的表达 | 第49-52页 |
| 4.3.6 纯化蛋白的浓度测定 | 第52页 |
| 4.3.7 Western blot鉴定 | 第52页 |
| 4.4 讨论 | 第52-54页 |
| 第五章 猪细环病毒2型间接ELISA方法的建立 | 第54-65页 |
| 5.1 材料 | 第54-56页 |
| 5.1.1 试验设备 | 第54页 |
| 5.1.2 主要生化试剂 | 第54-55页 |
| 5.1.3 主要试剂的配制 | 第55-56页 |
| 5.2 方法 | 第56-58页 |
| 5.2.1 间接ELISA操作步骤 | 第56页 |
| 5.2.2 抗原包被浓度和血清稀释度的确定 | 第56页 |
| 5.2.3 封闭液的确定 | 第56-57页 |
| 5.2.4 封闭时间的确定 | 第57页 |
| 5.2.5 血清反应时间的确定 | 第57页 |
| 5.2.6 酶标二抗稀释度的确定 | 第57页 |
| 5.2.7 酶标二抗反应时间的确定 | 第57页 |
| 5.2.8 底物显色时间的确定 | 第57-58页 |
| 5.2.9 阴、阳性血清临界值的确定 | 第58页 |
| 5.2.10 特异性试验 | 第58页 |
| 5.2.11 重复性试验 | 第58页 |
| 5.2.12 临床样品的检测 | 第58页 |
| 5.3 结果 | 第58-63页 |
| 5.3.1 抗原包被浓度及血清稀释倍数的确定 | 第58-59页 |
| 5.3.2 封闭液的确定 | 第59-60页 |
| 5.3.3 封闭时间的确定 | 第60页 |
| 5.3.4 血清反应时间的确定 | 第60-61页 |
| 5.3.5 酶标二抗稀释度的确定 | 第61页 |
| 5.3.6 酶标二抗反应时间的确定 | 第61-62页 |
| 5.3.7 显色时间的确定 | 第62页 |
| 5.3.8 间接ELISA阴、阳性血清临界值的确定 | 第62页 |
| 5.3.9 特异性试验 | 第62-63页 |
| 5.3.10 重复性试验 | 第63页 |
| 5.3.11 临床样品的检测 | 第63页 |
| 5.4 讨论 | 第63-65页 |
| 第六章 猪细环病毒2型LAMP检测方法的建立 | 第65-75页 |
| 6.1 材料 | 第65-66页 |
| 6.1.1 病毒样品和临床病料 | 第65页 |
| 6.1.2 主要生化试剂 | 第65-66页 |
| 6.1.3 主要仪器 | 第66页 |
| 6.2 方法 | 第66-68页 |
| 6.2.1 DNA的提取 | 第66页 |
| 6.2.2 引物与合成 | 第66-67页 |
| 6.2.3 病毒标准阳性质粒的制备 | 第67页 |
| 6.2.4 TTSuV2 LAMP检测方法的建立 | 第67页 |
| 6.2.5 LAMP敏感性试验 | 第67-68页 |
| 6.2.6 LAMP特异性试验 | 第68页 |
| 6.2.7 LAMP可视化试验 | 第68页 |
| 6.2.8 重复性试验 | 第68页 |
| 6.2.9 对临床样品的检测 | 第68页 |
| 6.3 结果 | 第68-74页 |
| 6.3.1 标准阳性质粒的制备 | 第68-69页 |
| 6.3.2 反应体系优化 | 第69-70页 |
| 6.3.3 LAMP反应体系 | 第70页 |
| 6.3.4 反应条件优化 | 第70-71页 |
| 6.3.5 敏感性试验 | 第71-72页 |
| 6.3.6 特异性试验 | 第72页 |
| 6.3.7 LAMP反应可视化结果的判定 | 第72-73页 |
| 6.3.8 LAMP重复性试验 | 第73页 |
| 6.3.9 临床采集样品的检测 | 第73-74页 |
| 6.4 讨论 | 第74-75页 |
| 全文总结 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 附录 | 第83-85页 |
| 作者简历 | 第85页 |
