| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第1章 绪论 | 第17-30页 |
| 1.1 大豆肽研究进展 | 第17-21页 |
| 1.1.1 大豆肽简介 | 第17页 |
| 1.1.2 大豆肽理化性质 | 第17页 |
| 1.1.3 大豆肽功能与应用现状 | 第17-19页 |
| 1.1.4 大豆肽制备工艺 | 第19-21页 |
| 1.2 蛋白酶的研究进展 | 第21-24页 |
| 1.2.1 蛋白酶简介 | 第21页 |
| 1.2.2 蛋白酶种类 | 第21-22页 |
| 1.2.3 蛋白酶应用现状 | 第22-24页 |
| 1.3 芽胞杆菌蛋白表达系统 | 第24-28页 |
| 1.3.1 芽胞杆菌表达系统简介 | 第24页 |
| 1.3.2 影响芽胞杆菌蛋白表达的因素 | 第24-25页 |
| 1.3.3 高产蛋白酶基因工程菌的构建 | 第25-27页 |
| 1.3.4 高产蛋白酶发酵工艺优化 | 第27-28页 |
| 1.4 地衣芽胞杆菌简介 | 第28-29页 |
| 1.5 本研究的目的和意义 | 第29-30页 |
| 第2章 材料和方法 | 第30-47页 |
| 2.1 本实验所用材料 | 第30-36页 |
| 2.1.1 所用菌株及表达质粒 | 第30-32页 |
| 2.1.2 PCR引物 | 第32页 |
| 2.1.3 培养基成分和本实验所用抗生素的使用浓度 | 第32-33页 |
| 2.1.4 实验所用酶及试剂 | 第33页 |
| 2.1.5 实验所用抽提溶液及缓冲溶液 | 第33-36页 |
| 2.1.6 主要实验仪器 | 第36页 |
| 2.2 实验所用方法 | 第36-47页 |
| 2.2.1 基本分子生物学方法 | 第36-38页 |
| 2.2.1.1 DNA的体外重组操作 | 第36页 |
| 2.2.1.2 大肠杆菌质粒DNA的小量抽提 | 第36页 |
| 2.2.1.3 地衣芽胞杆菌总DNA的小量抽提 | 第36-37页 |
| 2.2.1.4 地衣芽胞杆菌质粒的提取 | 第37页 |
| 2.2.1.5 扩增反应 | 第37-38页 |
| 2.2.1.6 DNA的酶切及连接 | 第38页 |
| 2.2.1.7 DNA的纯化及回收 | 第38页 |
| 2.2.2 重组质粒的构建 | 第38-40页 |
| 2.2.2.1 基因敲除载体的构建 | 第38-39页 |
| 2.2.2.2 地衣芽胞杆菌启动子蛋白酶表达质粒的构建 | 第39页 |
| 2.2.2.3 地衣芽胞杆菌双启动子蛋白酶表达质粒的构建 | 第39页 |
| 2.2.2.4 地衣芽胞杆菌信号肽蛋白酶表达质粒的构建 | 第39-40页 |
| 2.2.3 大肠杆菌重组质粒的转化 | 第40-41页 |
| 2.2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第40页 |
| 2.2.3.2 大肠杆菌转化子的菌落PCR验证 | 第40-41页 |
| 2.2.4 地衣芽胞杆菌表达质粒的转化 | 第41-42页 |
| 2.2.4.1 地衣芽胞杆菌感受态细胞的制备及电转化 | 第41页 |
| 2.2.4.2 地衣芽胞杆菌转化子的菌落PCR验证 | 第41-42页 |
| 2.2.5 地衣芽胞杆菌的基因敲除 | 第42页 |
| 2.2.6 地衣芽胞杆菌产胞外蛋白酶发酵培养基优化 | 第42-43页 |
| 2.2.6.1 碳源（玉米淀粉）浓度的优化 | 第42页 |
| 2.2.6.2 氮源（豆粕）浓度的优化 | 第42-43页 |
| 2.2.6.3 无机氮源（硫酸铵）浓度的优化 | 第43页 |
| 2.2.6.4 玉米浆浓度的优化 | 第43页 |
| 2.2.6.5 培养基正交优化 | 第43页 |
| 2.2.7 地衣芽胞杆菌产胞外蛋白酶发酵条件优化 | 第43-44页 |
| 2.2.7.1 种龄对胞外蛋白酶活力的影响 | 第43页 |
| 2.2.7.2 接种量对胞外蛋白酶活力的影响 | 第43页 |
| 2.2.7.3 装液量对胞外蛋白酶活力的影响 | 第43-44页 |
| 2.2.7.4 培养条件正交工艺优化 | 第44页 |
| 2.2.8 胞外蛋白酶发酵及测定 | 第44-45页 |
| 2.2.8.1 地衣芽胞杆菌产胞外蛋白酶发酵 | 第44页 |
| 2.2.8.2 福林酚法测定蛋白酶酶活力 | 第44页 |
| 2.2.8.3 蛋白酶标准曲线的制作 | 第44页 |
| 2.2.8.4 蛋白酶活力的测定 | 第44-45页 |
| 2.2.9 大豆肽酶解工艺 | 第45-46页 |
| 2.2.9.1 大豆肽中蛋白表达及大分子蛋白降解程度检测 | 第45-46页 |
| 2.2.9.2 SDS-PAGE电泳分析表达产物 | 第46页 |
| 2.2.10 数据处理 | 第46-47页 |
| 第3章 结果 | 第47-77页 |
| 3.1 蛋白酶基因的筛选 | 第47-50页 |
| 3.1.1 蛋白酶工程菌的构建 | 第47-48页 |
| 3.1.2 不同酶蛋白发酵效果评价 | 第48-50页 |
| 3.1.2.1 酪氨酸标准曲线的制作 | 第48-49页 |
| 3.1.2.2 发酵结果 | 第49-50页 |
| 3.2 宿主菌的筛选 | 第50-54页 |
| 3.2.1 bacA敲除菌株DW2ΔbacA的构建 | 第50-52页 |
| 3.2.1.1 bacA敲除菌株的构建 | 第50-52页 |
| 3.2.1.2 地衣芽胞杆菌 ΔbacA的构建 | 第52页 |
| 3.2.2 胞外蛋白酶AprE不同游离表达工程菌的构建 | 第52-53页 |
| 3.2.3 胞外蛋白酶AprE不同游离表达工程菌发酵验证 | 第53-54页 |
| 3.3 启动子的筛选 | 第54-61页 |
| 3.3.1 筛选启动子提高蛋白酶产量 | 第54-58页 |
| 3.3.1.1 不同启动子蛋白酶表达载体的构建 | 第54-56页 |
| 3.3.1.2 不同启动子蛋白酶工程菌的构建 | 第56-57页 |
| 3.3.1.3 启动子对蛋白酶产量的影响 | 第57-58页 |
| 3.3.2 人工双启动子表达体系的构建 | 第58-61页 |
| 3.3.2.1 双启动子蛋白酶表达载体的构建 | 第58-59页 |
| 3.3.2.2 双启动子蛋白酶工程菌的构建 | 第59-60页 |
| 3.3.2.3 双启动子对蛋白酶产量的影响 | 第60-61页 |
| 3.4 信号肽的筛选 | 第61-65页 |
| 3.4.1 不同信号肽蛋白酶表达载体的构建 | 第61-63页 |
| 3.4.2 不同信号肽蛋白酶工程菌的构建 | 第63-64页 |
| 3.4.3 信号肽对蛋白酶产量的影响 | 第64-65页 |
| 3.5 发酵培养基的优化 | 第65-69页 |
| 3.5.1 碳源（玉米淀粉）浓度的优化 | 第65页 |
| 3.5.2 有机氮源（豆粕）浓度的优化 | 第65-66页 |
| 3.5.3 无机氮源（硫酸铵）浓度的优化 | 第66-67页 |
| 3.5.4 玉米浆浓度的优化 | 第67-68页 |
| 3.5.5 培养基正交优化工艺 | 第68-69页 |
| 3.6 发酵条件的优化 | 第69-73页 |
| 3.6.1 种龄 | 第70页 |
| 3.6.2 接种量 | 第70-71页 |
| 3.6.3 装液量 | 第71-72页 |
| 3.6.4 培养条件正交优化工艺 | 第72-73页 |
| 3.7 豆粕酶解工艺优化 | 第73-77页 |
| 3.7.1 料水比对大豆肽的影响 | 第73-74页 |
| 3.7.2 蛋白酶液添加量对大豆肽的影响 | 第74-75页 |
| 3.7.3 不同酶解时间对大豆肽的影响 | 第75-77页 |
| 第4章 结论与展望 | 第77-80页 |
| 4.1 结论 | 第77-78页 |
| 4.2 展望 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-85页 |
| 附录 | 第85-89页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第89-90页 |
| 致谢 | 第90页 |
