| 摘要 | 第5-8页 |
| abstract | 第8-9页 |
| 主要符号表 | 第16-17页 |
| 第1章 绪论 | 第17-30页 |
| 1.1 果胶及果胶酶 | 第17-21页 |
| 1.1.1 果胶和果胶质 | 第17-18页 |
| 1.1.2 果胶酶 | 第18-19页 |
| 1.1.3 微生物法生产果胶酶 | 第19-20页 |
| 1.1.4 果胶酶的应用 | 第20-21页 |
| 1.2 酶的定向进化与分子改造 | 第21-22页 |
| 1.2.1 定向进化 | 第21-22页 |
| 1.2.2 理性设计 | 第22页 |
| 1.2.3 半理性设计 | 第22页 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 | 第22-27页 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达菌株 | 第23-24页 |
| 1.3.2 表达载体 | 第24页 |
| 1.3.3 启动子 | 第24-25页 |
| 1.3.4 蛋白水解作用的控制 | 第25-27页 |
| 1.4 生物酶法精练 | 第27-28页 |
| 1.5 前期工作 | 第28页 |
| 1.6 本研究目的与内容 | 第28-30页 |
| 第2章 材料与方法 | 第30-47页 |
| 2.1 实验材料与仪器设备 | 第30-35页 |
| 2.1.1 实验菌株 | 第30页 |
| 2.1.2 质粒 | 第30-31页 |
| 2.1.3 培养基 | 第31页 |
| 2.1.4 引物 | 第31-33页 |
| 2.1.5 主要缓冲液 | 第33-34页 |
| 2.1.6 酶与生化试剂 | 第34页 |
| 2.1.7 主要仪器设备 | 第34-35页 |
| 2.2 实验方法与步骤 | 第35-47页 |
| 2.2.1 质粒DNA的抽提 | 第35页 |
| 2.2.2 酵母总DNA的抽提 | 第35-36页 |
| 2.2.3 溶液回收DNA | 第36页 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳回收DNA | 第36页 |
| 2.2.5 大肠杆菌化转感受态细胞的制备及转化 | 第36-37页 |
| 2.2.6 大肠杆菌电转感受态细胞的制备及转化 | 第37页 |
| 2.2.7 毕赤酵母感受态细胞的制备及转化 | 第37-38页 |
| 2.2.8 菌落PCR验证重组子 | 第38页 |
| 2.2.9 Bradford法测定蛋白浓度 | 第38-39页 |
| 2.2.10 SDS-PAGE | 第39页 |
| 2.2.11 碱性果胶酶在大肠杆菌里的表达和纯化 | 第39-40页 |
| 2.2.12 毕赤酵母表达载体的构建 | 第40-41页 |
| 2.2.13 平板筛选高拷贝菌株 | 第41页 |
| 2.2.14 碱性果胶酶基因在毕赤酵母里的诱导表达 | 第41页 |
| 2.2.15 碱性果胶酶酶活及动力学常数的测定 | 第41-42页 |
| 2.2.16 qPCR检测目的基因的拷贝数 | 第42-43页 |
| 2.2.17 重组毕赤酵母高密度发酵 | 第43-44页 |
| 2.2.18 定点突变 | 第44页 |
| 2.2.19 大肠杆菌随机突变体文库的建立及筛选 | 第44-45页 |
| 2.2.20 同源序列比对 | 第45-46页 |
| 2.2.21 3D结构的分析 | 第46页 |
| 2.2.22 生物酶法精练 | 第46-47页 |
| 第3章 结果与分析 | 第47-62页 |
| 3.1 碱性果胶酶在毕赤酵母里的高效表达 | 第47-51页 |
| 3.1.1 果胶底物平板筛选高拷贝菌株 | 第47页 |
| 3.1.2 pPIC9K-pels表达载体的构建 | 第47-48页 |
| 3.1.3 G418抗性筛选高拷贝菌株 | 第48-49页 |
| 3.1.4 qRT-PCR检测毕赤酵母基因组中目的基因拷贝数 | 第49页 |
| 3.1.5 菌株GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels 1 高密度发酵 | 第49-51页 |
| 3.2 碱性果胶酶PEL168的分子改造 | 第51-62页 |
| 3.2.1 碱性果胶酶PEL168的理性设计 | 第51-52页 |
| 3.2.2 建立碱性果胶酶PEL168突变体文库 | 第52-53页 |
| 3.2.3 组合有利的点突变 | 第53-54页 |
| 3.2.4 47位点的定点饱和突变 | 第54-55页 |
| 3.2.5 同源序列比对 | 第55-56页 |
| 3.2.6 突变体的小结 | 第56-57页 |
| 3.2.7 Ca~(2+)对PEL168及其突变体的影响 | 第57-58页 |
| 3.2.8 突变机理的分析 | 第58-60页 |
| 3.2.9 生物酶法煮练 | 第60-62页 |
| 第4章 讨论与展望 | 第62-65页 |
| 4.1 讨论 | 第62-64页 |
| 4.1.1 碱性果胶酶在毕赤酵母里的高效表达 | 第62-63页 |
| 4.1.2 碱性果胶酶PEL168的分子改造 | 第63-64页 |
| 4.2 展望 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 硕士研究生期间主要成果 | 第75页 |
