| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 第一章 引言 | 第14-28页 |
| 1.1 CRISPR/Cas9的工作原理 | 第15-17页 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas的发展历史 | 第15-16页 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas的分类 | 第16页 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas9的结构和原理 | 第16-17页 |
| 1.2 CRISPR/Cas9在植物研究中的应用 | 第17-22页 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9在模式植物中应用 | 第18页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9在作物中的应用 | 第18-20页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9的其他应用 | 第20-21页 |
| 1.2.4 gRNA的设计 | 第21页 |
| 1.2.5 CRISPR/Cas9突变检测 | 第21-22页 |
| 1.2.6 如何减少CRISPR/Cas9的脱靶效率 | 第22页 |
| 1.3 展望 | 第22-28页 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9的进化 | 第22页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cpf1技术的兴起 | 第22-23页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9与植物体内的Agonaute介导的DNA甲基化研究比较 | 第23-24页 |
| 1.3.4 NgAGO基因组编辑技术的原理与应用 | 第24-25页 |
| 1.3.5 CRISPR/Cas9对多个基因的编辑 | 第25-26页 |
| 1.3.6 CRISPR/Cas9在多倍体中的应用困难 | 第26-28页 |
| 第二章 传统CRISPR/Cas9在小麦中的应用 | 第28-33页 |
| 2.1 实验材料 | 第28页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第28页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第28页 |
| 2.1.3 载体和引物 | 第28页 |
| 2.2 实验方法 | 第28-29页 |
| 2.2.1 密码子优化 | 第28页 |
| 2.2.2 原生质体的制备及转化 | 第28-29页 |
| 2.3 实验结果 | 第29-32页 |
| 2.3.1 CRISPR/Cas9密码子优化 | 第29页 |
| 2.3.2 靶位点的设计及载体构建 | 第29-30页 |
| 2.3.3 小麦原生质体转化检测 | 第30-31页 |
| 2.3.4 目的片段测序 | 第31页 |
| 2.3.5 转化小麦植株及检测 | 第31-32页 |
| 2.4 讨论与结论 | 第32-33页 |
| 第三章 CRISPR/Cas9的改造与应用 | 第33-51页 |
| 3.1 实验材料 | 第33页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第33页 |
| 3.1.2 实验试剂 | 第33页 |
| 3.1.3 载体和引物 | 第33页 |
| 3.2 实验方法 | 第33-42页 |
| 3.2.1 CRISPR/Cas9密码子优化及改造 | 第33页 |
| 3.2.2 CRISPR/Cas9载体与靶位点的构建 | 第33-34页 |
| 3.2.3 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备与转化 | 第34-35页 |
| 3.2.4 质粒提取 | 第35页 |
| 3.2.5 农杆菌感受态制备 | 第35-36页 |
| 3.2.6 农杆菌EHA105转化 | 第36页 |
| 3.2.7 水稻愈伤组织的诱导和转化 | 第36-37页 |
| 3.2.8 转化植株的阳性鉴定 | 第37-38页 |
| 3.2.9 阳性植株目标基因测序 | 第38页 |
| 3.2.10 水稻叶片总RNA的提取 | 第38-39页 |
| 3.2.11 DNA酶处理纯化RNA | 第39页 |
| 3.2.12 总RNA的定量与完整性检测 | 第39页 |
| 3.2.13 cDNA的合成 | 第39-40页 |
| 3.2.14 cDNA的质量检测 | 第40页 |
| 3.2.15 荧光定量qRT-PCR | 第40-41页 |
| 3.2.16 Cas9-VQR体外酶切活性检测 | 第41-42页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第42-49页 |
| 3.3.1 CRISPR/Cas9 PAM位点在水稻和小麦全基因组CDS上的数量比较 | 第42-43页 |
| 3.3.2 Cas9定点突变及其蛋白活性检测 | 第43页 |
| 3.3.3 CRISPR/Cas9-VQR载体构建及gRNAs设计 | 第43-45页 |
| 3.3.4 OsPDS-gRNAs体外酶切活性检测 | 第45-46页 |
| 3.3.5 CRISPR/Cas9-VQR/PDS载体的构建及检测并转化水稻 | 第46-47页 |
| 3.3.6 转化植株的表型观察及突变位点检测 | 第47-48页 |
| 3.3.7 OsPDS突变植株的表达量分析 | 第48-49页 |
| 3.4 讨论与结论 | 第49-51页 |
| 第四章 CRISPR/Cpf1的优化与应用 | 第51-56页 |
| 4.1 实验材料 | 第51页 |
| 4.1.1 植物材料和菌株 | 第51页 |
| 4.1.2 实验试剂 | 第51页 |
| 4.1.3 载体和引物 | 第51页 |
| 4.2 实验方法 | 第51页 |
| 4.2.1 CRISPR/Cpf1密码子优化及改造 | 第51页 |
| 4.2.2 CRISPR/Cpf1靶位点设计与合成 | 第51页 |
| 4.3 实验结果及分析 | 第51-55页 |
| 4.3.1 CRISPR/Cpf1密码子优化结果 | 第51-52页 |
| 4.3.2 CRISPR/Cpf1载体结果分析 | 第52页 |
| 4.3.3 Cpf1-gRNA在OsPDS基因序列上的位置及其结构 | 第52-53页 |
| 4.3.4 Cpf1-gRNA载体的构建及检测 | 第53页 |
| 4.3.5 阳性植株的鉴定 | 第53-54页 |
| 4.3.6 阳性植株的表型观察 | 第54页 |
| 4.3.7 OsPDS突变植株的表达量分析 | 第54-55页 |
| 4.4 讨论与结论 | 第55-56页 |
| 第五章 全文总结 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-63页 |
| 附录 | 第63-66页 |
| 致谢 | 第66-67页 |
| 作者简历 | 第67页 |
