| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 缩略语一览表 | 第14-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-36页 |
| 1.1 海洋真菌次级代谢产物及生合成研究进展 | 第15-24页 |
| 1.1.1 海洋真菌来源的次级代谢产物 | 第15-20页 |
| 1.1.1.1 海洋真菌的多样性及其来源 | 第15-17页 |
| 1.1.1.2 海洋真菌来源的天然产物 | 第17-18页 |
| 1.1.1.3 海洋真菌来源的的新化合物种类 | 第18-20页 |
| 1.1.2 真菌次级代谢产物生物合成研究 | 第20-24页 |
| 1.1.2.1 几株曲霉真菌基因组信息与功能的预测 | 第20-22页 |
| 1.1.2.2 沉默基因簇的激活 | 第22-24页 |
| 1.2 真菌遗传转化系统 | 第24-34页 |
| 1.2.1 真菌营养缺陷型筛选标记 | 第25-28页 |
| 1.2.2 转化方法的选择 | 第28-34页 |
| 1.2.2.1 PEG/CaCl_2介导的转化方法 | 第28页 |
| 1.2.2.2 其他方式的转化方法 | 第28-29页 |
| 1.2.2.3 原生质体的制备 | 第29-34页 |
| 1.3 展望 | 第34页 |
| 1.4 本课题的研究思路与技术路线 | 第34-36页 |
| 第二章 海洋曲霉属菌株Z5的分离与全基因组SMS基因簇的挖掘 | 第36-50页 |
| 2.1 菌株来源 | 第36页 |
| 2.2 材料 | 第36-39页 |
| 2.2.1 培养基配方 | 第36-38页 |
| 2.2.2 主要缓冲液 | 第38页 |
| 2.2.3 主要实验试剂 | 第38页 |
| 2.2.4 主要仪器 | 第38-39页 |
| 2.3 方法 | 第39-41页 |
| 2.3.1 OSMAC方法检测次级代谢产物 | 第39页 |
| 2.3.1.1 活化Z5菌株 | 第39页 |
| 2.3.1.2 培养发酵 | 第39页 |
| 2.3.1.3 萃取以及TLC、 HPLC分析 | 第39页 |
| 2.3.2 全基因组测序挖掘Z5生物合成基因簇 | 第39-41页 |
| 2.3.2.1 基因组提取方法 | 第39-40页 |
| 2.3.2.2 全基因组测序 | 第40-41页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第41-48页 |
| 2.4.1 OSMAC分析Z5菌株生产SMs能力 | 第41-43页 |
| 2.4.2 Z5菌株的基因组提取与全基因组测序 | 第43-45页 |
| 2.4.3 Z5菌株的基因组进化分析 | 第45-46页 |
| 2.4.4 SMs生物合成基因簇的挖掘与分析 | 第46-48页 |
| 2.5 外结 | 第48-50页 |
| 第三章 原生质体的制备与转化 | 第50-67页 |
| 3.1 菌株来源 | 第50页 |
| 3.2 材料 | 第50-52页 |
| 3.2.1 主要缓冲液 | 第50-51页 |
| 3.2.2 培养基 | 第51-52页 |
| 3.3 方法 | 第52-56页 |
| 3.3.1 菌丝体的培养 | 第52-53页 |
| 3.3.1.1 孢子液的获得 | 第52页 |
| 3.3.1.2 菌丝体的培养 | 第52-53页 |
| 3.3.2 直接酶解法制备原生质体 | 第53-54页 |
| 3.3.2.1 酶解液的制备 | 第53页 |
| 3.3.2.2 原生质体的制备与收集 | 第53-54页 |
| 3.3.3 β-巯基乙醇预处理菌丝体与原生质体的制备 | 第54-55页 |
| 3.3.3.1 菌丝体的收集与预处理 | 第54页 |
| 3.3.3.2 原生质体的制备 | 第54页 |
| 3.3.3.3 采用不同酶组合进行酶解 | 第54-55页 |
| 3.3.4 原生质体的收集 | 第55页 |
| 3.3.4.1 过滤收集原生质体 | 第55页 |
| 3.3.4.2 分层方法收集原生质体 | 第55页 |
| 3.3.5 原生质体的检测与再生 | 第55-56页 |
| 3.3.5.1 原生质体的检测 | 第56页 |
| 3.3.5.2 原生质体的再生 | 第56页 |
| 3.4 结果与分析 | 第56-63页 |
| 3.4.1 直接酶解法制备原生质体 | 第56-57页 |
| 3.4.2 β-巯基乙醇处理法制备原生质体 | 第57-62页 |
| 3.4.2.1 菌丝体的预裂解 | 第57页 |
| 3.4.2.2 不同的复合酶配比对原生质体制备率的影响 | 第57-58页 |
| 3.4.2.3 不同酶解时间对菌株原生质体制备影响 | 第58-60页 |
| 3.4.2.4 不同分离与纯化方法制备原生质体的比较 | 第60-62页 |
| 3.4.3 原生质体再生率的检测 | 第62-63页 |
| 3.4.3.1 原生质体的检测 | 第62-63页 |
| 3.4.3.2 原生质体的再生率 | 第63页 |
| 3.5 讨论 | 第63-65页 |
| 3.6 小结 | 第65-67页 |
| 第四章 Z5遗传转化体系的构建 | 第67-91页 |
| 4.1 DOUBLE-JOINT PCR构建基因盒 | 第67-74页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第67-68页 |
| 4.1.1.1 菌株与质粒 | 第67页 |
| 4.1.1.2 培养基 | 第67-68页 |
| 4.1.1.3 主要试剂与溶液 | 第68页 |
| 4.1.2 主要仪器 | 第68页 |
| 4.1.3 方法 | 第68-70页 |
| 4.1.1.1 曲霉Z5基因组提取 | 第68页 |
| 4.1.3.2 聚合酶链式反应(PCR) | 第68-69页 |
| 4.1.3.3 目的条带的割胶回收以及纯化 | 第69页 |
| 4.1.3.4 本章节所用到的PCR引物 | 第69-70页 |
| 4.1.4 Double-Joint PCR方法构建两段基因盒 | 第70-73页 |
| 4.1.4.1 第一轮PCR反应 | 第70-71页 |
| 4.1.4.2 第二轮PCR反应 | 第71-72页 |
| 4.1.4.3 第三轮PCR反应 | 第72-73页 |
| 4.1.5 Double-Joint PCR构建三段基因盒 | 第73-74页 |
| 4.1.5.1 第一轮PCR反应 | 第73页 |
| 4.1.5.2 第二轮PCR反应 | 第73-74页 |
| 4.1.5.3 第三轮PCR反应 | 第74页 |
| 4.2 PEG/CACL_2介导的Z5原生质体的转化 | 第74-79页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第75-76页 |
| 4.2.1.1 培养基 | 第75页 |
| 4.2.1.2 试剂与缓冲液 | 第75-76页 |
| 4.2.2 方法 | 第76-79页 |
| 4.2.2.1 菌丝体的培养 | 第76页 |
| 4.2.2.2 5-FOA浓度的测试 | 第76-78页 |
| 4.2.2.3 原生质体的制备与收集 | 第78-79页 |
| 4.2.2.4 pyrG基因盒转化原生质体 | 第79页 |
| 4.3 结果与分析 | 第79-88页 |
| 4.3.1 菌株Z5 pyrG基因选用与比对 | 第79-80页 |
| 4.3.2 基因敲除盒的构建 | 第80-82页 |
| 4.3.2.1 两片段的pyrG基因盒 | 第80-81页 |
| 4.3.2.2 三片段的pyrG基因盒 | 第81-82页 |
| 4.3.3 5-FOA致死浓度的测试 | 第82-86页 |
| 4.3.3.1 5-FOA浓度对构巢曲霉和烟曲霉野生株与ΔpyrG生长的影响 | 第83页 |
| 4.3.3.2 5-FOA浓度对曲霉属菌株Z5野生株生长的影响 | 第83-86页 |
| 4.3.4 菌株Z5的原生质体转化 | 第86-88页 |
| 4.3.4.1 pyrG基因盒的原生质体转化 | 第86页 |
| 4.3.4.2 转化子复筛 | 第86-87页 |
| 4.3.4.3 转化子的验证 | 第87-88页 |
| 4.4 讨论 | 第88-90页 |
| 4.5 小结 | 第90-91页 |
| 第五章 总结与展望 | 第91-94页 |
| 5.1 全文总结 | 第91-92页 |
| 5.2 研究特色 | 第92-93页 |
| 5.3 展望 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-111页 |
| 附表 | 第111-123页 |
| 作者简介 | 第123页 |
