| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 1 前言 | 第8-17页 |
| 1.1 研究背景 | 第8-11页 |
| 1.1.1 不同来源的乳糖酶 | 第8-9页 |
| 1.1.2 乳糖酶水解乳糖作用机制 | 第9-10页 |
| 1.1.3 乳糖酶国内外的应用及研究进展 | 第10-11页 |
| 1.2 乳糖酶的表达系统 | 第11-15页 |
| 1.2.1 大肠杆菌表达系统 | 第11-12页 |
| 1.2.2 毕赤酵母表达系统 | 第12-15页 |
| 1.3 本文研究的意义与主要内容 | 第15-17页 |
| 1.3.1 选题的目的意义 | 第15页 |
| 1.3.2 研究的主要内容 | 第15-17页 |
| 2 材料与方法 | 第17-35页 |
| 2.1 材料 | 第17-24页 |
| 2.1.1 实验中使用的菌种、质粒与引物 | 第17页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第17-19页 |
| 2.1.3 仪器与设备 | 第19-20页 |
| 2.1.4 抗生素 | 第20页 |
| 2.1.5 工具酶及DNA、蛋白Marker | 第20-21页 |
| 2.1.6 培养基 | 第21-22页 |
| 2.1.7 实验有关溶液的配制 | 第22-24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-35页 |
| 2.2.1 生物信息学分析工具 | 第24页 |
| 2.2.2 β-半乳糖苷酶基因LacLM毕赤酵母载体的构建 | 第24-26页 |
| 2.2.3 转化大肠杆菌DH5α | 第26-27页 |
| 2.2.4 Pichia pastoris GS115工程菌株的构建及验证 | 第27-29页 |
| 2.2.5 酵母工程菌的培养和β-半乳糖苷酶的诱导表达 | 第29页 |
| 2.2.6 β-半乳糖苷酶酶的SDS-PAGE分析 | 第29-30页 |
| 2.2.7 毕赤酵母超声破碎的条件 | 第30-31页 |
| 2.2.8 毕赤酵母重组子总RNA的提取 | 第31页 |
| 2.2.9 RNA逆转录为cDNA步骤 | 第31-32页 |
| 2.2.10 cDNA PCR反应验证 | 第32页 |
| 2.2.11 菌体密度的测定 | 第32页 |
| 2.2.12 Bradford法测定乳糖酶粗酶液蛋白质含量 | 第32-33页 |
| 2.2.13 乳糖酶重组菌中β-半乳糖苷酶活性测定 | 第33-34页 |
| 2.2.14 优化ZW3β-半乳糖苷酶在Pichia pastoris中的表达条件 | 第34-35页 |
| 3 结果与讨论 | 第35-61页 |
| 3.1 β-半乳糖苷酶酶LacLM的生物信息学分析 | 第35-45页 |
| 3.1.1 LacLM基因核苷酸序列分析 | 第35页 |
| 3.1.2 LacLM氨基酸序列分析 | 第35-37页 |
| 3.1.3 蛋白保守功能区分析 | 第37-38页 |
| 3.1.4 β-半乳糖苷酶LacLM糖基化位点分析 | 第38-39页 |
| 3.1.5 β-半乳糖苷酶LacLM信号肽分析 | 第39-40页 |
| 3.1.6 β-半乳糖苷酶LacLM蛋白二级结构预测 | 第40-41页 |
| 3.1.7 β-半乳糖苷酶LacLM蛋白三级结构预测分析 | 第41-43页 |
| 3.1.8 β-半乳糖苷酶LacLM序列在毕赤酵母中稀有密码子的预测 | 第43-45页 |
| 3.2 PCR扩增马乳酒样乳杆菌乳糖酶基因 | 第45-46页 |
| 3.3 重组载体的构建及验证 | 第46-49页 |
| 3.4 P.pastoris工程菌株的构建及筛选 | 第49-52页 |
| 3.4.1 酵母转化子的PCR鉴定 | 第49-51页 |
| 3.4.2 多拷贝重组子的筛选 | 第51-52页 |
| 3.5 大亚基LacL与小亚基LacM分别在毕赤酵母中的表达 | 第52-54页 |
| 3.6 毕赤酵母重组子总RNA的提取与反转录 | 第54-55页 |
| 3.7 乳糖酶摇瓶发酵条件的优化 | 第55-59页 |
| 3.7.1 毕赤酵母重组子生长曲线的测定 | 第55-56页 |
| 3.7.2 发酵温度对乳糖酶表达水平的影响 | 第56页 |
| 3.7.3 甲醇添加量对乳糖酶表达水平的影响 | 第56-57页 |
| 3.7.4 发酵初始pH值对乳糖酶表达水平的影响 | 第57页 |
| 3.7.5 溶氧对乳糖酶表达水平的影响 | 第57-59页 |
| 3.7.6 最优发酵时间 | 第59页 |
| 3.8 讨论 | 第59-61页 |
| 4 结论 | 第61-62页 |
| 5 展望 | 第62-63页 |
| 6 参考文献 | 第63-71页 |
| 7 致谢 | 第71-72页 |
| 附录 | 第72-73页 |
