| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-14页 |
| 本论文的缩略语表 | 第14-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-35页 |
| ·古菌及硫化叶菌概述 | 第16-19页 |
| ·古菌的发现 | 第16页 |
| ·古菌的分类 | 第16-17页 |
| ·古菌的基本特征 | 第17-18页 |
| ·古菌的研究和应用价值 | 第18页 |
| ·硫化叶菌概述 | 第18-19页 |
| ·DNA的损伤与修复 | 第19-21页 |
| ·DNA损伤 | 第19页 |
| ·同源重组修复 | 第19-21页 |
| ·古菌Hjm(He1308a)解旋酶 | 第21-23页 |
| ·He1308蛋白 | 第21-22页 |
| ·古菌Hjm解旋酶 | 第22-23页 |
| ·DExD/H-box解旋酶超家族 | 第23-27页 |
| ·DExD/H-box超家族概述 | 第23-24页 |
| ·DExD/H-box解旋酶的分类和结构 | 第24-26页 |
| ·古菌中的DExD/H-box解旋酶 | 第26-27页 |
| ·硫化叶菌S.islandiucs Rey15A(E233S)遗传操作系统 | 第27-33页 |
| ·基因敲除系统 | 第27-31页 |
| ·冰岛硫化叶菌表达载体 | 第31-33页 |
| ·本研究的目的及意义 | 第33-35页 |
| 第二章 Hjm酶活调控结构域V的必需性分析 | 第35-46页 |
| ·材料与方法 | 第35-40页 |
| ·菌株与质粒 | 第35页 |
| ·培养基 | 第35-36页 |
| ·SisHjm同源建模 | 第36页 |
| ·MID敲除策略 | 第36-38页 |
| ·pMID敲除载体构建 | 第38-39页 |
| ·E233S细胞的电转化 | 第39页 |
| ·整合型菌株筛选 | 第39-40页 |
| ·突变体增殖实验 | 第40页 |
| ·实验结果 | 第40-44页 |
| ·SisHjm结构域划分及敲除载体的构建 | 第40-42页 |
| ·Sis/Hjm domainV、Sis/Hjm domainⅢ-Ⅴ整合型菌株的筛选 | 第42-43页 |
| ·酶活性调控结构域V对细胞是必需的 | 第43-44页 |
| ·讨论 | 第44-45页 |
| ·小结 | 第45-46页 |
| 第三章 Hjm野生型及突变体的遗传回补 | 第46-63页 |
| ·材料与方法 | 第46-50页 |
| ·菌株与质粒 | 第46页 |
| ·Hjm回补系统的构建 | 第46-47页 |
| ·辛伐他汀浓度的确定 | 第47-48页 |
| ·hjm突变体回补载体的构建 | 第48页 |
| ·pET15b-N-His-Hjm载体构建 | 第48页 |
| ·Hjm表达纯化 | 第48-49页 |
| ·Western blot | 第49-50页 |
| ·实验结果 | 第50-59页 |
| ·辛伐他汀使用浓度的确定 | 第50页 |
| ·自身启动子调控的hjm能够回补,阿拉伯糖启动子不能 | 第50-52页 |
| ·用于回补的hjm突变体 | 第52-53页 |
| ·结构域Ⅴ中保守的R667,R669和R671对细胞是必需的 | 第53-55页 |
| ·结构域Ⅲ和HTH基序对细胞是必需的 | 第55页 |
| ·HjmR327A和HjmF458A能够完成回补 | 第55-56页 |
| ·表达、纯化His-tagged Hjm | 第56-57页 |
| ·UV或MMS处理后,回补质粒pSSRNhjm仍稳定存在 | 第57页 |
| ·细胞内的Hjm蛋白量是维持不变的 | 第57-59页 |
| ·讨论 | 第59-61页 |
| ·小结 | 第61-63页 |
| 第四章 冰岛硫化叶菌DExD/H-box家族新型解旋酶基因的敲除 | 第63-74页 |
| ·材料与方法 | 第63-66页 |
| ·菌株及生长条件 | 第63页 |
| ·生物信息学分析 | 第63-64页 |
| ·pK(marker置换)敲除策略 | 第64-65页 |
| ·敲除载体pK电转化进入E233S细胞 | 第65-66页 |
| ·转化子的筛选和验证 | 第66页 |
| ·实验结果 | 第66-70页 |
| ·Sulfolobus islandicus基因组编码15个DExD/H-box解旋酶 | 第66-67页 |
| ·pK敲除载体的构建 | 第67-68页 |
| ·SiRe_0591,SiRe_0618,SiRe_1122,SiRe_1789,SiRe_1887,SiRe_1977不能被敲除 | 第68-69页 |
| ·SiRe_0681,SiRe_1605是非必需基因 | 第69-70页 |
| ·讨论 | 第70-73页 |
| ·小结 | 第73-74页 |
| 第五章 SiRe_0681和SiRe_1605体内功能分析 | 第74-95页 |
| ·材料与方法 | 第74-79页 |
| ·菌株及生长条件 | 第74页 |
| ·生长曲线测定 | 第74-75页 |
| ·CFU(colony formation unit)测定 | 第75页 |
| ·流式分析取样及细胞固定 | 第75页 |
| ·流式检测 | 第75-76页 |
| ·△SiRe_0681回补系统的构建 | 第76-77页 |
| ·取样及总RNA提取 | 第77页 |
| ·mRNA富集 | 第77-78页 |
| ·cDNA文库构建及测序 | 第78-79页 |
| ·实验结果 | 第79-89页 |
| ·△SiRe_0681比野生型REY15A生长更快 | 第79-81页 |
| ·△SiRe_1605对损伤剂MMS更敏感 | 第81-82页 |
| ·△SiRe_0681具有更多的G2期细胞 | 第82-83页 |
| ·SiRe_0681回补系统的验证 | 第83-85页 |
| ·SiRe_0681回补菌株能够恢复野生型的表型 | 第85-88页 |
| ·△SiRe_0681中一些细胞分裂蛋白上调 | 第88-89页 |
| ·△SiRe_1605中一些核酸代谢蛋白以及DNA损伤修复蛋白下调 | 第89页 |
| ·讨论 | 第89-91页 |
| ·小结 | 第91-95页 |
| 第六章 结论与展望 | 第95-99页 |
| ·本研究的创新性 | 第95页 |
| ·全文总结 | 第95-97页 |
| ·Hjm在细胞内的活性和表达受到严格的调控 | 第95-96页 |
| ·SiRe_0681和SiRe_1605的功能 | 第96-97页 |
| ·展望 | 第97-99页 |
| ·Hjm突变体的生化活性鉴定 | 第97页 |
| ·hjm在细胞内的调控机制 | 第97页 |
| ·SiRe_0681和SiRe_1605的酶活性及确切功能 | 第97-98页 |
| ·其它的DExD-box解旋酶的必需性和功能分析 | 第98-99页 |
| 附录 | 第99-109页 |
| 附录一：主要药品和试剂 | 第99页 |
| 附录二：主要仪器设备 | 第99-100页 |
| 附录三：培养基的成分及配制 | 第100-101页 |
| 附录四：主要溶液及配制 | 第101-102页 |
| 附录五：PCR及酶切体系 | 第102页 |
| 附录六：载体构建步骤 | 第102-104页 |
| 附录七：古菌感受态细胞的制备 | 第104页 |
| 附录八：重叠延伸PCR的步骤 | 第104-105页 |
| 附录九：实验中的引物及质粒 | 第105-108页 |
| 附录十：实验中的菌株及基因型 | 第108-109页 |
| 参考文献 | 第109-121页 |
| 致谢 | 第121-122页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第122-123页 |
| 外文论文 | 第123-150页 |
| 附件 | 第150页 |
